SNARE Kaçakçılığı kullanarak Geri Dönüşüm Endozomlarını İncelemek ve Analiz Etmek için Mikroskopi Tabanlı Tahlil
Summary
Geri dönüşüm endozomları endosomal tübüler ağın bir parçasıdır. Burada, GFP-STX13’i organel işaretleyici olarak kullanarak geri dönüşüm endozomlarının dinamiklerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Geri dönüşüm endozomları (RE’ ler), tüm hücre tiplerinde erken/sıralama endozomlarından üretilen tübüler-veziküler organellerdir. Bu organeller, melanositler tarafından üretilen lizozomla ilgili bir organel olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar. REs, melanosit spesifik kargoyu oluşumları sırasında prematüre melanozomlara teslim eder. Hermansky-Pudlak sendromunun birkaç mutantında gözlenen REs neslindeki tıkanıklık, cilt, saç ve göz hipopigmentasyonu ile sonuçlanır. Bu nedenle, REs’in dinamiklerini (sayı ve uzunluğa bakın) incelemek, bu organellerin normal ve hastalık koşullarındaki işlevini anlamak için yararlıdır. Bu çalışmada, yerleşik bir SNARE STX13 kullanarak RE dinamiklerini ölçmeyi amaçlıyoruz.
Introduction
Melanin pigmentlerinin biyosentezi, geleneksel lizozomlarla birlikte var olan melanosit spesifik lizozomla ilişkili bir organel (LRO) olan melanozomlarda görülür. Endosit sistemi, iyonlaştırıcı radyasyona karşı cilt rengi ve fotoproteksiyon için gerekli olan melanozomların biyogenezinde önemli bir rol oynar1,2,3. Bu işlem sırasında melanin sentezleme enzimleri erken/tasnif endozomları üzerinde sıralanır ve daha sonra geri dönüşüm endozomları (REs)4,5,6,7,8,9,10 adı verilen tübüler veya veziküler endozomlar aracılığıyla erken melanozomlara taşınır. Bu organellerin hedeflenmesi ve füzyonu, tamamen fonksiyonel pigmentli melanozomların olgunlaşmasını düzenler7,11,12,13,14. Bu organellerin oluşumundaki kusurlar veya bu organellere giden yük tasnifleri, Hermansky-Pudlak sendromunda gözlenen okülokütan albinizme ve diğer klinik fenotiplere neden olur15,16.
Burada REs’i incelemek ve analiz etmek için basit bir mikroskopi tabanlı tekniği açıklıyoruz. Bu yöntemde, geri dönüşüm endozomları17 ve melanositlerdeki endozomlar ve melanozomlar arasındaki döngüler üzerinde bulunan bir transmembran proteini olan Qa-SNARE Syntaxin (STX)13’den yararlandık12,18. Ayrıca, N-terminal yapılandırılmamış düzenleyici etki alanının (synn veya STX13Δ129) silinmesi, SNARE’nin melanozomlara doğru ileriye doğru kaçakçılık yolunu ölçen melanozomlarda sıkışmasını sağlar12. Çalışmalarımızda bilinen bir geri dönüşüm endosomal marker Rab GTPase (Rab)11 kullandık14,19. GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 ve TYRP1 proteinlerinin vahşi tip melanositlerde floresan görüntülemesi ve ardından göreceli lokalizasyonlarının ölçülmesi, melanozomlara hedeflemelerinin yanı sıra RE’lerin doğasını ve dinamiklerini sağlayacaktır. Bu nedenle, bu, MELANOSITLERDEKI REs dinamiklerini görselleştirmek ve ölçmek için kullanılabilecek basit bir tekniktir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geri dönüşüm endozomları endosit organellerden oluşan bir kohort haline gelerek tüm hücre tiplerinde kargonun hücre yüzeyine geri dönüşümüne aracılık ederler21,22,23,24,25. Melanositler gibi özel hücre tiplerinde, bu organeller kısmen biyogenezleri için kaçakçılık rotalarını melanozomlara yönlendirmektedir3,16,26.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Biyoteknoloji Bölümü tarafından desteklendi (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 to SRGS); Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu (CRG/2019/000281 to SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 to SRGS) ve IISc-DBT ortaklık programı (SRGS’ye). Bölümdeki altyapı DST-FIST, DBT ve UGC tarafından desteklendi. AMB, DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02) tarafından desteklendi.
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
References
- Dell’Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
- Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes–dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
- Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, (2020).
- Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
- Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
- Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
- Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
- Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
- Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
- Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
- Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
- Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
- Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).
- Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).
- Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
- Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
- Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
- Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
- Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
- Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
- Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
- Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
- Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
- Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
- Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
- Desfougeres, Y., D’Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
- Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).
