SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석하는 현미경 기반 분석
Summary
재활용 내분은 내피 관 네트워크의 일부입니다. 여기서는 GFP-STX13을 세포구마커로 사용하여 재활용 내종의 역학을 정량화하는 방법을 제시합니다.
Abstract
재활용 내분 (REs)은 모든 세포 유형의 초기 /정렬 내분비에서 생성 된 관 형 혈관 세포기관입니다. 이 세포기관은 멜라노좀의 생물 발생에 중요한 역할을, 멜라닌 세포에 의해 생성 된 리소솜 관련 세포기관. REs는 멜라닌세포 특이적 화물을 형성 하는 동안 조기 멜라노솜에 전달합니다. 헤르만스키-푸들락 증후군의 여러 돌연변이체에서 관찰되는 REs의 생성에 막힘은 피부, 모발 및 눈의 저색소침착을 초래합니다. 따라서, REs의 역학(수 및 길이 참조)을 연구하는 것은 정상 및 질병 조건에서 이러한 세포기관의 기능을 이해하는 데 유용하다. 이 연구에서는 상주 SNARE STX13을 사용하여 RE 역학을 측정하는 것을 목표로합니다.
Introduction
멜라닌 안료의 생합성은 멜라노솜, 멜라노세포 특이리소성 세포질(LRO)에서 발생하며, 이는 기존의 리소좀과 공존한다. 내세포 시스템은 멜라노솜의 생물 발생에 중요한 역할을하며, 피부 색및 이온화 방사선에 대한 포토보호에 요구된다1,2,3. 이 과정에서 멜라닌 합성 효소는 초기/선별 내분모에 분류된 다음, 내분비(REs)4,5,6,7,8,9,10이라고 불리는 관 또는 생구 내분모를 통해 조기 멜라노좀으로 이송된다. 이러한 세포기관의 표적화 및 융합은 완전 기능성 색소멜라노솜7,11,12,13,14의 성숙을 조절한다. 이러한 세포기관 또는 화물 선별의 형성에 결함이 있는 것은 허만스키-푸들락 증후군15,16에서 관찰된 오큘로쿠탈 백색증 및 그밖 임상 표현형을 일으키는 원인이 됩니다.
여기에서 우리는 REs를 연구하고 분석하기 위하여 간단한 현미경 기지를 둔 기술을 기술합니다. 이 방법으로, 우리는 멜라노세포12,18에서 내모와 멜라노솜을 분류하는 사이 내모성 및 멜라노솜을 분류하는 것 사이 내모성 17 및 주기에 상주하는 막 단백질, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13을 이용했습니다. 또한, N단비정형 규제 도메인(즉 SynN 또는 STX13Δ129)을 삭제하면 SNARE가 멜라노솜에 갇히게 되어 멜라노솜12를 향한 전방 인신매매 경로를 측정할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 알려진 재활용 내피 마커 Rab GTPase (Rab)11을 사용했습니다14,19. 단백질 GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab129 및 TYRP1의 형광 이미징은 야생형 멜라노사이클의 양량화에 이어 상대적 국소화의 정량화에 따라 멜라노솜에 대한 표적화 이외에 REs의 특성과 역학을 제공할 것이다. 따라서, 이것은 멜라닌세포에서 REs의 역학을 시각화하고 측정하는 데 사용할 수 있는 간단한 기술이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
재활용 내시경은 내세포 소기관의 코호트이며, 모든 세포 유형21,22,23,24,25에서 화물의 재활용을 세포 표면으로 중재한다. 멜라닌 세포와 같은 전문적인 세포 모형에서, 이 세포기관은 부분적으로 그들의 생물 발생을 위한 melanosomes를 향해 그들의 인신 매매 경로를 전환<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 생명공학부(BT/PR32489/BRB/10/1786/2019~SRGS)에 의해 지원되었다. 과학 및 공학 연구 위원회 (CRG/ 2019/000281 SRGS); DBT-NBACD(BT/HRD-NBA-NWB/2019-20 ~SRGS) 및 IISc-DBT 파트너십 프로그램(SRGS). 부서의 인프라는 DST-FIST, DBT 및 UGC에 의해 지원되었습니다. AMB는 DBT-JRF(DBT/2015/IISc/NJ-02)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
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