המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE
Summary
מיחזור אנדוזומים הם חלק מהרשת הצינורית האנדוסומית. כאן אנו מציגים שיטה לכמת את הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים באמצעות GFP-STX13 כסמן אברונים.
Abstract
מיחזור אנדוזומים (REs) הם אברונים צינוריים-ארסיים שנוצרו מאנדוזומים מוקדמים /מיון בכל סוגי התאים. אברונים אלה ממלאים תפקיד מפתח בביוגנזה של מלנוזומים, אברון הקשור ליזוזום המיוצר על ידי מלנוציטים. REs לספק את המטען ספציפי מלנוציט למלנוזומים מוקדמים במהלך היווצרותם. חסימה בדור של REs, נצפתה במספר מוטציות של תסמונת הרמנסקי-Pudlak, גורמת hypopigmentation של העור, השיער, והעין. לכן, לימוד הדינמיקה (מתייחס למספר ולאורך) של REs שימושי כדי להבין את הפונקציה של אברונים אלה במצבים נורמליים ומחלות. במחקר זה, אנו שואפים למדוד את הדינמיקה RE באמצעות תושב SNARE STX13.
Introduction
ביוסינטזה של פיגמנטים מלנין מתרחשת מלנוזומים, אברון ספציפי מלנוציטים (LRO) כי קיים יחד עם ליזוזומים קונבנציונליים. המערכת האנדוציטית ממלאת תפקיד מרכזי בביוגנזה של מלנוזומים, הנדרשת לצבע עור והגנה פוטו-הגנתית מפני קרינה מייננת1,2,3. במהלך תהליך זה, אנזימי סינתזה מלנין ממוינים על אנדוזומים מוקדמים / מיון ולאחר מכן מועברים מלנוזומים מוקדמים באמצעות אנדוזומים צינוריים או אופניים הנקראים אנדוזומים מיחזור (REs)4,5,6,7,8,9,10. פילוח והיתוך של אברונים אלה לווסת את ההתבגרות של מלנומוזומים פיגמנטיים פונקציונליים לחלוטין7,11,12,13,14. פגמים בהיווצרות של אברונים אלה או מיון מטען לאברונים אלה גורמים לבקנות oculocutaneous ופנוטיפים קליניים אחרים, שנצפו תסמונת הרמנסקי-Pudlak15,16.
כאן אנו מתארים טכניקה פשוטה המבוססת על מיקרוסקופיה כדי ללמוד ולנתח את REs. בשיטה זו, ניצלנו חלבון transmembrane, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 התב”ע המונה על מיחזור אנדוזומים17 ומחזורים בין מיון אנדוזומים ומלנוזומים במלנוציטים12,18. יתר על כן, מחיקה של N-terminal לא מובנה דומיין רגולטורי (כלומר SynN או STX13Δ129) מאפשרת SNARE להיתקע melanosomes, אשר מודד את מסלול הסחר קדימה לכיוון melanosome12. השתמשנו בסמן אנדוסומאלי ידוע מיחזור Rab GTPase (Rab)11 במחקרים שלנו14,19. הדמיית פלואורסצנטיות של החלבונים GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 ו- TYRP1 במלנוציטים מסוג בר ואחריו כימות הלוקליזציה היחסית שלהם תספק את הטבע והדינמיקה של REs בנוסף למיקודם למלנוזומים. לכן, זוהי טכניקה פשוטה שניתן להשתמש בה כדי לדמיין ולמדוד את הדינמיקה של REs במלנוציטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיחזור אנדוזומים הם קבוצה של אברונים אנדוציטיים, והם מתווכים את מיחזור המטען למשטח התא בכל סוגי התאים21,22,23,24,25. בסוגי תאים מיוחדים כגון מלנוציטים, אברונים אלה מסיטים חלקית את נתיב הסחר שלהם לכיוון המל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 ל-SRGS); ועדת מחקר מדע והנדסה (CRG/2019/000281 ל-SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 ל-SRGS) ותוכנית השותפות IISc-DBT (ל-SRGS). התשתית במחלקה נתמכה על ידי DST-FIST, DBT ו- UGC. AMB נתמך על ידי DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
References
- Dell’Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
- Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes–dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
- Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, (2020).
- Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
- Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
- Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
- Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
- Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
- Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
- Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
- Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
- Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
- Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).
- Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).
- Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
- Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
- Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
- Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
- Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
- Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
- Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
- Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
- Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
- Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
- Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
- Desfougeres, Y., D’Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
- Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).
