Le test basé sur la microscopie pour étudier et analyser les endosomes de recyclage à l’aide du trafic SNARE
Summary
Les endosomes de recyclage font partie du réseau tubulaire endosomal. Nous présentons ici une méthode pour quantifier la dynamique du recyclage des endosomes en utilisant GFP-STX13 comme marqueur d’organite.
Abstract
Les endosomes de recyclage (RE) sont des organites tubulaires-vésiculaires générés à partir d’endosomes précoces/triés dans tous les types de cellules. Ces organites jouent un rôle clé dans la biogenèse des mélanosomes, un organite lié aux lysosomes produit par les mélanocytes. Les ER délivrent la cargaison spécifique aux mélanocytes aux mélanosomes prématurés pendant leur formation. Le blocage dans la génération d’EI, observé chez plusieurs mutants du syndrome de Hermansky-Pudlak, entraîne une hypopigmentation de la peau, des cheveux et des yeux. Par conséquent, l’étude de la dynamique (se référer au nombre et à la longueur) des ER est utile pour comprendre la fonction de ces organites dans des conditions normales et pathologiques. Dans cette étude, nous visons à mesurer la dynamique des ER à l’aide d’un SNARE STX13 résident.
Introduction
La biosynthèse des pigments de mélanine se produit dans les mélanosomes, un organite spécifique des lysosomes (LRO) spécifique aux mélanocytes qui coexiste avec les lysosomes conventionnels. Le système endocytaire joue un rôle clé dans la biogenèse des mélanosomes, nécessaires à la couleur de la peau et à la photoprotection contre les rayonnements ionisants1,2,3. Au cours de ce processus, les enzymes de synthèse de la mélanine sont triées sur des endosomes précoces / triés, puis transportées vers des mélanosomes prématurés par le biais d’endosomes tubulaires ou vésiculaires appelés endosomes de recyclage (URE)4,5,6,7,8,9,10. Le ciblage et la fusion de ces organites régulent la maturation des mélanosomes pigmentés entièrement fonctionnels7,11,12,13,14. Des défauts dans la formation de ces organites ou le tri de la cargaison vers ces organites provoquent un albinisme oculo-cutané et d’autres phénotypes cliniques, observés dans le syndrome de Hermansky-Pudlak15,16.
Nous décrivons ici une technique simple basée sur la microscopie pour étudier et analyser les ER. Dans cette méthode, nous avons tiré parti d’une protéine transmembranaire, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 qui réside sur le recyclage des endosomes17 et les cycles entre le tri des endosomes et des mélanosomes dans les mélanocytes12,18. De plus, la suppression du domaine réglementaire non structuré N-terminal (à savoir SynN ou STX13Δ129) permet au SNARE de rester coincé dans les mélanosomes, ce qui mesure la voie de trafic vers le mélanosome12. Nous avons utilisé un marqueur endosomamal de recyclage connu Rab GTPase (Rab)11 dans nos études14,19. L’imagerie par fluorescence des protéines GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 et TYRP1 dans les mélanocytes de type sauvage, suivie de la quantification de leur localisation relative, fournira la nature et la dynamique des ERE en plus de leur ciblage sur les mélanosomes. Il s’agit donc d’une technique simple qui peut être utilisée pour visualiser et mesurer la dynamique des ER dans les mélanocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les endosomes de recyclage sont une cohorte d’organites endocytaires, et ils interviennent dans le recyclage de la cargaison à la surface cellulaire dans tous les types de cellules21,22,23,24,25. Dans les types cellulaires spécialisés tels que les mélanocytes, ces organites détournent en partie leur voie de trafic vers les mélanosomes pour leur biogen?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Département de biotechnologie (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 à la SSRS); Conseil de la recherche en sciences et en génie (CRG/2019/000281 à la SSRS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 à la SSR) et programme de partenariat IISc-DBT (à la SSR). L’infrastructure du ministère était soutenue par DST-FIST, DBT et UGC. AMB était soutenu par DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
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