O ensaio baseado em microscopia para estudar e analisar os endossomos de reciclagem usando o tráfico de SNARE
Summary
Os endosários de reciclagem fazem parte da rede tubular endosomal. Aqui apresentamos um método para quantificar a dinâmica da reciclagem de endósmos usando GFP-STX13 como marcador de organela.
Abstract
Endosomos de reciclagem (REs) são organelas tubulares-vesiculares geradas a partir de endossóis precoces/de triagem em todos os tipos de células. Essas organelas desempenham um papel fundamental na biogênese dos melanósimos, uma organela relacionada ao lysosome produzida por melanócitos. Os REs fornecem a carga específica de melanócitos para melanomas prematuros durante sua formação. O bloqueio na geração de REs, observado em vários mutantes da síndrome de Hermansky-Pudlak, resulta em hipopigmentação da pele, cabelo e olho. Portanto, estudar a dinâmica (referem-se ao número e comprimento) das REs é útil para entender a função dessas organelas em condições normais e da doença. Neste estudo, pretendemos medir a dinâmica RE utilizando um SNARE STX13 residente.
Introduction
A biossíntese de pigmentos de melanina ocorre em melanósias, uma organela lysosome específica de melanócito (LRO) que coexiste com lysososomes convencionais. O sistema endocítico desempenha um papel fundamental na biogênese dos melanomas, necessário para a cor da pele e fotoproteção contra radiação ionizante1,2,3. Durante esse processo, as enzimas sintetizadoras de melanina são classificadas em endosários precoces/de triagem e depois transportadas para melanomas prematuros através de endosários tubulares ou vesiculares chamados endosários de reciclagem (REs)4,5,6,7,8,9,10. O direcionamento e fusão dessas organelas regulam o amadurecimento de melanosomes pigmentados totalmente funcionais7,11,12,13,14. Defeitos na formação dessas organelas ou triagem de cargas para essas organelas causam albinismo oculocutâneo e outros fenótipos clínicos, observados na síndrome de Hermansky-Pudlak15,16.
Aqui descrevemos uma técnica simples baseada em microscopia para estudar e analisar os REs. Neste método, aproveitamos uma proteína transmembrana, a Rexexina Qa-SNARE (STX)13 que reside na reciclagem de endossolas17 e ciclos entre endossários de triagem e melanócitos12,18. Além disso, a exclusão do domínio regulatório não estruturado n-terminal (ou seja, SynN ou STX13Δ129) permite que o SNARE fique preso em melanomas, o que mede o caminho de tráfico para o melanosome12. Usamos um marcador endossomal de reciclagem conhecido Rab GTPase (Rab)11 em nossos estudos14,19. A imagem de fluorescência das proteínas GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 e TYRP1 em melanócitos do tipo selvagem seguidos de quantificação de sua localização relativa fornecerá a natureza e a dinâmica das REs, além de sua segmentação para melanósimos. Assim, esta é uma técnica simples que pode ser usada para visualizar e medir a dinâmica dos REs em melanócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os endossóis de reciclagem são uma coorte de organelas endocíticas, e mediam a reciclagem de carga para a superfície celular em todos os tipos de células21,22,23,24,25. Em tipos de células especializadas, como os melanócitos, essas organelas desviam parcialmente sua rota de tráfico em direção aos melanomas para sua biogênese3,16,26.<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 à SRGS); Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (CRG/2019/000281 à SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 para SRGS) e programa de parceria IISc-DBT (para SRGS). A infraestrutura no departamento foi apoiada pelo DST-FIST, DBT e UGC. A AMB foi apoiada pelo DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
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