El ensayo basado en microscopía para estudiar y analizar los endosomas de reciclaje utilizando el tráfico de SNARE
Summary
Los endosomas de reciclaje forman parte de la red tubular endosomal. Aquí presentamos un método para cuantificar la dinámica del reciclaje de endosomas utilizando GFP-STX13 como marcador de orgánulos.
Abstract
Los endosomas de reciclaje (TE) son orgánulos tubulares-vesiculares generados a partir de endosomas tempranos / clasificadores en todos los tipos de células. Estos orgánulos juegan un papel clave en la biogénesis de los melanosomas, un orgánulo relacionado con los lisosomas producido por los melanocitos. Los TE entregan la carga específica de melanocitos a los melanosomas prematuros durante su formación. El bloqueo en la generación de TE, observado en varios mutantes del síndrome de Hermansky-Pudlak, resulta en hipopigmentación de la piel, el cabello y los ojos. Por lo tanto, estudiar la dinámica (consulte el número y la longitud) de los TE es útil para comprender la función de estos orgánulos en condiciones normales y de enfermedad. En este estudio, nuestro objetivo es medir la dinámica de RE utilizando un SNARE STX13 residente.
Introduction
La biosíntesis de pigmentos de melanina ocurre en los melanosomas, un orgánulo relacionado con lisosomas específicos de melocitos (LRO) que coexiste con los lisosomas convencionales. El sistema endocítico juega un papel clave en la biogénesis de los melanosomas, necesarios para el color de la piel y la fotoprotección frente a las radiaciones ionizantes1,2,3. Durante este proceso, las enzimas sintetizadoras de melanina se clasifican en endosomas tempranos y luego se transportan a melanosomas prematuros a través de endosomas tubulares o vesiculares llamados endosomas de reciclaje (TE)4,5,6,7,8,9,10. La focalización y fusión de estos orgánulos regulan la maduración de melanosomas pigmentados completamente funcionales7,11,12,13,14. Los defectos en la formación de estos orgánulos o la clasificación de carga a estos orgánulos causan albinismo oculocutáneo y otros fenotipos clínicos, observados en el síndrome de Hermansky-Pudlak15,16.
Aquí describimos una técnica simple basada en microscopía para estudiar y analizar los TE. En este método, hemos aprovechado una proteína transmembrana, la sintaxina Qa-SNARE (STX)13 que reside en el reciclaje de endosomas17 y ciclos entre clasificación de endosomas y melanosomas en melanocitos12,18. Además, la eliminación del dominio regulador no estructurado N-terminal (es decir, SynN o STX13Δ129) permite que la SNARE se atasque en los melanosomas, lo que mide la ruta de tráfico hacia el melanosoma12. Hemos utilizado un conocido marcador endosomal de reciclaje Rab GTPasa (Rab)11 en nuestros estudios14,19. Las imágenes de fluorescencia de las proteínas GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 y TYRP1 en melanocitos de tipo silvestre seguidas de la cuantificación de su localización relativa proporcionarán la naturaleza y la dinámica de los ER, además de su orientación a los melanosomas. Por lo tanto, esta es una técnica simple que se puede utilizar para visualizar y medir la dinámica de los TE en los melanocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los endosomas de reciclaje son una cohorte de orgánulos endocíticos, y median el reciclaje de la carga a la superficie celular en todos los tipos de células21,22,23,24,25. En tipos celulares especializados como los melanocitos, estos orgánulos desvían parcialmente su ruta de tráfico hacia los melanosomas para su biogénesis3,16,26…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Biotecnología (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 a SRGS); Junta de Investigación en Ciencia e Ingeniería (CRG/2019/000281 a SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 a SRGS) y el programa de asociación IISc-DBT (a SRGS). La infraestructura en el departamento fue apoyada por DST-FIST, DBT y UGC. AMB fue apoyado por DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
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