إعادة تدوير الاندوسومات هي جزء من شبكة أنبوبية endosomal. هنا نقدم طريقة لقياس ديناميات إعادة تدوير الاندوسومات باستخدام GFP-STX13 كعلامة عضوية.
إعادة تدوير الاندوسومات (REs) هي العضيات الأنبوبية المركبات المتولدة من الإنسومات المبكرة / الفرز في جميع أنواع الخلايا. تلعب هذه العضيات دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات ، وهي عضوية مرتبطة بالليسوسوم تنتجها الخلايا الصباغية. REs تسليم البضائع الخاصة بالخلايا الصباغية إلى الميلانوسومات المبكرة أثناء تشكيلها. انسداد في جيل REs، لوحظ في العديد من المسوخ من متلازمة هيرمانسكي بودلاك، يؤدي إلى نقص التصبغ من الجلد والشعر والعين. لذلك ، فإن دراسة ديناميكيات (الرجوع إلى عدد وطول) REs مفيدة لفهم وظيفة هذه العضيات في الظروف الطبيعية والمرضية. في هذه الدراسة، ونحن نهدف إلى قياس ديناميات RE باستخدام STX13 SNARE المقيمين.
يحدث التمثيل الحيوي لأصباغ الميلانين في الميلانوسومات ، وهي عضوية مرتبطة بالليسوسومات الخاصة بالخلايا الصباغية (LRO) تتعايش مع الليسوسومات التقليدية. يلعب النظام الإندوسيتيكي دورا رئيسيا في التكوين الحيوي للميلانوسومات ، المطلوبة للون البشرة وprotection ضد الإشعاع المؤين1،2،3. خلال هذه العملية، يتم فرز الإنزيمات توليف الميلانين على الاندوسومات في وقت مبكر / الفرز ومن ثم نقلها إلى الميلانوسومات المبكرة من خلال الاندوسومات أنبوبي أو المركبات تسمى إعادة تدوير الانسومات (REs)4،5،6،7،8،9،10. استهداف وانصهار هذه العضيات تنظيم نضوج الميلانوسومات المصطبغة تعمل بكامل طاقتها7،11،12،13،14. العيوب في تشكيل هذه العضيات أو فرز البضائع إلى هذه العضيات تسبب المهق oculocutaneous وغيرها من الأنماط الظاهرية السريرية، لوحظ في متلازمة هيرمانسكي بودلاك15،16.
هنا نصف تقنية بسيطة تعتمد على المجهر لدراسة وتحليل REs. في هذه الطريقة، لقد استفدنا من بروتين ترانسممبران، Qa-SNARE Syntaxin (STX)13 الذي يقيم على إعادة تدوير endosomes17 ودورات بين الاندوسومات الفرز والميلانوسومات في الخلايا الصباغية12،18. علاوة على ذلك ، فإن حذف النطاق التنظيمي غير المنظم N-terminal (أي SynN أو STX13Δ129) يسمح لل SNARE بالتعثر في الميلانوسومات ، والذي يقيس مسار الاتجار إلى الأمام نحو الميلانوسوم12. لقد استخدمنا علامة إعادة تدوير نهايةوسومية معروفة Rab GTPase (Rab)11 في دراساتنا14,19. التصوير الفلوري للبروتينات GFP-STX13WT، GFP-STX13Δ129، mCherry-Rab11، و TYRP1 في الخلايا الصباغية البرية من النوع تليها تحديد كمي لتوطينها النسبي سيوفر طبيعة وديناميات REs بالإضافة إلى استهدافها للميلانوسومات. وهكذا، هذه تقنية بسيطة يمكن استخدامها لتصور وقياس ديناميات REs في الخلايا الصباغية.
إعادة تدوير الاندوسومات هي مجموعة من العضيات الانسطية، وأنها تتوسط في إعادة تدوير البضائع إلى سطح الخلية في جميع أنواع الخلايا21،22،23،24،25. في أنواع الخلايا المتخصصة مثل الخلايا الصباغية، تحول هذه ال?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل قسم التكنولوجيا الحيوية (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 إلى SRGS)؛ مجلس بحوث العلوم والهندسة (CRG/2019/000281 إلى SRGS)؛ DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 إلى SRGS) وبرنامج شراكة IISc-DBT (إلى SRGS). تم دعم البنية التحتية في القسم من قبل DST-FIST و DBT و UGC. تم اعتماد AMB من قبل DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |