De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel
Summary
Recycling endosomen maken deel uit van het endosomale buisvormige netwerk. Hier presenteren we een methode om de dynamiek van recycling-endosomen te kwantificeren met behulp van GFP-STX13 als organelmarker.
Abstract
Recycling-endosomen (RE’s) zijn tubulair-vesiculaire organellen die worden gegenereerd uit vroege / sorterende endosomen in alle celtypen. Deze organellen spelen een sleutelrol in de biogenese van melanosomen, een lysosoom-gerelateerd organel geproduceerd door melanocyten. RE’s leveren de melanocyt-specifieke lading aan premature melanosomen tijdens hun vorming. Blokkering bij het genereren van RE’s, waargenomen bij verschillende mutanten van het Hermansky-Pudlak-syndroom, resulteert in hypopigmentatie van huid, haar en ogen. Daarom is het bestuderen van de dynamiek (zie aantal en lengte) van RE’s nuttig om de functie van deze organellen in normale en ziekteomstandigheden te begrijpen. In deze studie willen we de RE-dynamiek meten met behulp van een resident SNARE STX13.
Introduction
Biosynthese van melaninepigmenten vindt plaats in melanosomen, een melanocyt-specifiek lysosoom-gerelateerd organel (LRO) dat naast conventionele lysosomen bestaat. Het endocytische systeem speelt een sleutelrol in de biogenese van melanosomen, die nodig zijn voor huidskleur en fotoprotectie tegen ioniserende straling1,2,3. Tijdens dit proces worden de melaninesynthetiserende enzymen gesorteerd op vroege / sorteer-endosomen en vervolgens getransporteerd naar premature melanosomen via tubulaire of vesiculaire endosomen die recycling-endosomen (RE’s) worden genoemd 4,5,6,7,7,8,9,10. De targeting en fusie van deze organellen reguleren de rijping van volledig functionele gepigmenteerde melanosomen7,11,12,13,14. Defecten in de vorming van deze organellen of ladingssortering naar deze organellen veroorzaken oculocutaan albinisme en andere klinische fenotypen, waargenomen bij Hermansky-Pudlak-syndroom15,16.
Hier beschrijven we een eenvoudige op microscopie gebaseerde techniek om de RE’s te bestuderen en te analyseren. Bij deze methode hebben we gebruik gemaakt van een transmembraaneiwit, Qa-SNARE Syntaxin (STX)13, dat zich bevindt op het recyclen van endosomen17 en cycli tussen het sorteren van endosomen en melanosomen in melanocyten12,18. Verder zorgt het verwijderen van N-terminaal ongestructureerd regulerend domein (namelijk SynN of STX13Δ129) ervoor dat de SNARE vast komt te zitten in melanosomen, die de voorwaartse smokkelroute naar het melanosoom meet12. We hebben een bekende recycling endosomale marker Rab GTPase (Rab)11 gebruikt in onze studies14,19. Fluorescentiebeeldvorming van de eiwitten GFP-STX13WT, GFP-STX13Δ129, mCherry-Rab11 en TYRP1 in melanocyten van het wilde type, gevolgd door kwantificering van hun relatieve lokalisatie, zal de aard en dynamiek van RE’s bieden naast hun targeting op melanosomen. Dit is dus een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om de dynamiek van RE’s in melanocyten te visualiseren en te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recycling-endosomen zijn een cohort van endocytische organellen en ze bemiddelen de recycling van lading naar het celoppervlak in alle celtypen21,22,23,24,25. In gespecialiseerde celtypen zoals melanocyten leiden deze organellen hun smokkelroute gedeeltelijk om naar de melanosomen voor hun biogenese3,16,26.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Department of Biotechnology (BT/PR32489/BRB/10/1786/2019 aan SRGS); Onderzoeksraad voor Wetenschap en Techniek (CRG/2019/000281 SRGS); DBT-NBACD (BT/HRD-NBA-NWB/38/2019-20 naar SRGS) en IISc-DBT partnerschapsprogramma (naar SRGS). De infrastructuur op de afdeling werd ondersteund door DST-FIST, DBT en UGC. AMB werd ondersteund door DBT-JRF (DBT/2015/IISc/NJ-02).
Materials
| anti-TYRP1 antibody (TA99) | ATCC | HB-8704 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668-500 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 022600-050 | |
| Phorbol-12-myristate-13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher Scientific | 31800-022 |
References
- Dell’Angelica, E. C. The building BLOC(k)s of lysosomes and related organelles. Current Opinion in Cell Biology. 16 (4), 458-464 (2004).
- Raposo, G., Marks, M. S. Melanosomes–dark organelles enlighten endosomal membrane transport. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (10), 786-797 (2007).
- Ohbayashi, N., Fukuda, M. Recent advances in understanding the molecular basis of melanogenesis in melanocytes. F1000Research. 9, (2020).
- Theos, A. C., et al. Functions of adaptor protein (AP)-3 and AP-1 in tyrosinase sorting from endosomes to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 16 (11), 5356-5372 (2005).
- Di Pietro, S. M., et al. BLOC-1 interacts with BLOC-2 and the AP-3 complex to facilitate protein trafficking on endosomes. Molecular Biology of the Cell. 17 (9), 4027-4038 (2006).
- Setty, S. R., et al. BLOC-1 is required for cargo-specific sorting from vacuolar early endosomes toward lysosome-related organelles. Molecular Biology of the Cell. 18 (3), 768-780 (2007).
- Delevoye, C., et al. AP-1 and KIF13A coordinate endosomal sorting and positioning during melanosome biogenesis. Journal of Cell Biology. 187 (2), 247-264 (2009).
- Bultema, J. J., Ambrosio, A. L., Burek, C. L., Di Pietro, S. M. BLOC-2, AP-3, and AP-1 proteins function in concert with Rab38 and Rab32 proteins to mediate protein trafficking to lysosome-related organelles. Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19550-19563 (2012).
- Sitaram, A., et al. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3178-3192 (2012).
- Nag, S., et al. Rab4A organizes endosomal domains for sorting cargo to lysosome-related organelles. Journal of Cell Science. 131 (18), (2018).
- Dennis, M. K., et al. BLOC-2 targets recycling endosomal tubules to melanosomes for cargo delivery. Journal of Cell Biology. 209 (4), 563-577 (2015).
- Jani, R. A., Purushothaman, L. K., Rani, S., Bergam, P., Setty, S. R. STX13 regulates cargo delivery from recycling endosomes during melanosome biogenesis. Journal Cell Science. 128 (17), 3263-3276 (2015).
- Shakya, S., et al. Rab22A recruits BLOC-1 and BLOC-2 to promote the biogenesis of recycling endosomes. EMBO Reports. 19 (12), 45918 (2018).
- Bowman, S. L., et al. A BLOC-1-AP-3 super-complex sorts a cis-SNARE complex into endosome-derived tubular transport carriers. Journal of Cell Biology. 220 (7), 202005173 (2021).
- Wei, M. L. Hermansky-Pudlak syndrome: a disease of protein trafficking and organelle function. Pigment Cell Research. 19 (1), 19-42 (2006).
- Bowman, S. L., Bi-Karchin, J., Le, L., Marks, M. S. The road to lysosome-related organelles: Insights from Hermansky-Pudlak syndrome and other rare diseases. Traffic. 20 (6), 404-435 (2019).
- Prekeris, R., Klumperman, J., Chen, Y. A., Scheller, R. H. Syntaxin 13 mediates cycling of plasma membrane proteins via tubulovesicular recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 143 (4), 957-971 (1998).
- Mahanty, S., et al. Rab9A is required for delivery of cargo from recycling endosomes to melanosomes. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (1), 43-59 (2016).
- Delevoye, C., et al. Recycling endosome tubule morphogenesis from sorting endosomes requires the kinesin motor KIF13A. Cell Reports. 6 (3), 445-454 (2014).
- Ha, L., et al. ARF functions as a melanoma tumor suppressor by inducing p53-independent senescence. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (26), 10968-10973 (2007).
- Soldati, T., Schliwa, M. Powering membrane traffic in endocytosis and recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (12), 897-908 (2006).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Hsu, V. W., Prekeris, R. Transport at the recycling endosome. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 528-534 (2010).
- Taguchi, T. Emerging roles of recycling endosomes. Journal of Biochemistry. 153 (6), 505-510 (2013).
- Goldenring, J. R. Recycling endosomes. Current Opinion in Cell Biology. 35, 117-122 (2015).
- Delevoye, C., Marks, M. S., Raposo, G. Lysosome-related organelles as functional adaptations of the endolysosomal system. Current Opinion in Cell Biology. 59, 147-158 (2019).
- Hsu, V. W., Bai, M., Li, J. Getting active: protein sorting in endocytic recycling. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 13 (5), 323-328 (2012).
- Desfougeres, Y., D’Agostino, M., Mayer, A. A modular tethering complex for endosomal recycling. Nature Cell Biology. 17 (5), 540-541 (2015).
- Le, L., Sires-Campos, J., Raposo, G., Delevoye, C., Marks, M. S. Melanosome biogenesis in the pigmentation of mammalian skin. Integrated Computational Biology. 61 (4), 1517-1545 (2021).
