Este protocolo describe una evaluación estandarizada de las sensibilidades de los medicamentos a los inhibidores de señalización dirigidos en modelos organoides derivados de pacientes con NSCLC.
Los nuevos cultivos organoides de cáncer en 3D derivados de muestras de pacientes clínicos representan un sistema modelo importante para evaluar la heterogeneidad intratumoral y la respuesta al tratamiento a los inhibidores dirigidos en el cáncer. El trabajo pionero en cánceres gastrointestinales y pancreáticos ha puesto de relieve la promesa de los organoides derivados de pacientes (PDO) como un sistema de cultivo cercano al paciente, con un número creciente de modelos emergentes. Del mismo modo, el trabajo en otros tipos de cáncer se ha centrado en establecer modelos organoides y optimizar los protocolos de cultivo. En particular, los modelos organoides de cáncer 3D mantienen la complejidad genética de las muestras tumorales originales y, por lo tanto, traducen los datos de secuenciación derivados del tumor en tratamiento con terapias dirigidas genéticamente informadas en un entorno experimental. Además, las DOP podrían fomentar la evaluación de tratamientos combinados racionales para superar la adaptación asociada a la resistencia de los tumores en el futuro. Este último se centra en intensos esfuerzos de investigación en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), ya que el desarrollo de resistencia en última instancia limita el éxito del tratamiento de los inhibidores dirigidos. Una evaluación temprana de los mecanismos terapéuticamente dirigidos utilizando las DOP de NSCLC podría ayudar a informar los tratamientos de combinación racionales. Este manuscrito describe un protocolo estandarizado para la evaluación basada en placas de cultivo celular de las sensibilidades de los fármacos a los inhibidores dirigidos en las DOP 3D derivadas del NSCLC, con una posible adaptabilidad a los tratamientos combinados y otras modalidades de tratamiento.
Las terapias personalizadas contra los impulsores oncogénicos han revolucionado el tratamiento del cáncer, mejorando la supervivencia del paciente y reduciendo los efectos secundarios mediados por el tratamiento1. Los recientes avances en el diagnóstico molecular y las tecnologías de secuenciación han puesto de relieve la complejidad de los tumores humanos, con una heterogeneidad espacial y temporal que afecta a la respuesta al tratamiento2. La recapitulación de estas diferencias subclonales en los modelos de cultivo celular se ha limitado durante mucho tiempo a investigar alteraciones seleccionadas de interés en líneas celulares que de otro modo serían uniformes. Los modelos de DOP 3D recientemente desarrollados generados a partir de biopsias tumorales o resecciones tumorales quirúrgicas permiten una mejor representación de la complejidad celular y la diafonía de señalización dentro del tejido tumoral derivado del paciente3. Como tal, los organoides tumorales derivados del cáncer gastrointestinal y pancreático se han generado con éxito y recapitulan la diversidad genética y los determinantes de la respuesta al tratamiento4,5,6. En el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), se reconocen los desafíos de desarrollo y establecimiento de organoides, y se necesita la optimización de las técnicas de cultivo y los factores de medios selectivos para permitir un uso más amplio y sistemático de las DOP de NSCLC en el futuro7,8.
El desarrollo de terapias combinatorias dirigidas a células tumorales residuales que resistan el tratamiento farmacológico inicial es esencial para inhibir el desarrollo de resistencias y, en última instancia, para mejorar la supervivencia del paciente9. Dada la complejidad arquitectónica de los cultivos de organoides, los parámetros clásicos de respuesta a los fármacos deben optimizarse para permitir pruebas precisas y reproducibles de las sensibilidades a los medicamentos. Se dispone de lecturas basadas en imágenes10,11 y ensayos clásicos de viabilidad celular que miden la abundancia de ATP celular6,12, entre otras técnicas, para perfilar las respuestas farmacológicas en cultivos de DOP. Aquí, desarrollamos y describimos un protocolo estandarizado para evaluar las sensibilidades de los medicamentos a la terapia dirigida contra los impulsores clínicos conocidos en los modelos de DOP de NSCLC.
Este manuscrito desarrolla y describe un protocolo estandarizado para evaluar la sensibilidad a los medicamentos en modelos de DOP 3D derivados de NSCLC. Además de los estudios de sensibilidad a los medicamentos, se necesita una mayor caracterización de los modelos organoides disponibles para determinar las causas subyacentes de las diferencias en la sensibilidad a los medicamentos. Esto puede incluir perfiles genéticos de organoides y muestras de pacientes y otros análisis disponibles para organoides, como la tinción inmunohistoquímica para marcadores de diferenciación y biomarcadores generales de señalización celular y fisiología13,29.
Pasos críticos en el protocolo
El protocolo descrito en este documento proporciona un flujo de trabajo estandarizado que permite análisis de sensibilidad a medicamentos precisos y reproducibles cuando se siguen cuidadosamente. Se debe tener especial cuidado en los siguientes pasos: digestión de TrypLE y DNAse I durante la generación de suspensiones unicelulares, siembra de suspensiones unicelulares en BME2, monitoreo del crecimiento de organoides hasta el tratamiento, cambios en los medios y alteración y lisis de organoides incrustados en BME2 durante la lectura de supervivencia celular basada en luminiscencia. (1) Si bien la digestión adicional de DNAse I después de la disociación de organoides basada en TrypLE no es esencial para expandir los modelos de organoides durante el mantenimiento regular del cultivo, la digestión de DNAse I no debe omitirse al sembrar para experimentos de escalada de fármacos, ya que garantiza una mejor separación de los grupos de organoides en suspensiones unicelulares y un recuento celular preciso. (2) La siembra de suspensión unicelular en BME2 representa un paso crítico dada la solidificación de BME2 a temperatura ambiente. Por lo tanto, se debe sembrar un máximo de 1-2 filas a la vez, y las muestras deben colocarse en hielo antes de sembrar filas adicionales. Cabe destacar que las células deben pipetearse hacia arriba y hacia abajo cuando se continúa la siembra para permitir una suspensión celular homogénea. (3) El crecimiento de los organoides debe ser monitoreado cuidadosamente durante la expansión de 7 días desde la siembra hasta el tratamiento. Un ejemplo de la evolución prevista figura en la figura 1B y en el cuadro complementario 1. Cabe destacar que la evaluación de los cambios en el tamaño de los organoides mediante microscopía de campo brillante y análisis de imágenes como se presenta en la Figura 1B puede permitir una evaluación precisa de las diferencias en el crecimiento de los organoides y los tiempos de duplicación. Los tiempos de duplicación pueden tener un impacto en las respuestas a los fármacos, como se discutió recientemente en la literatura30. Si la tasa de crecimiento de organoides excede significativamente el ejemplo presentado, se puede considerar un tiempo de expansión más corto hasta el inicio del tratamiento y una duración del tratamiento más corta. (4) Además, se debe tener especial cuidado al cambiar de medio para evitar aspirar organoides. La posición de siembra de los organoides incrustados BME2 en la posición de las 6 en punto permite una aspiración segura de los medios cuando las placas se giran en el sentido de las agujas del reloj en 180 ° y los medios se aspiran en la posición opuesta de los organoides. (5) Finalmente, la lisis exhaustiva de los organoides incrustados en BME2 durante la lectura de supervivencia es esencial para registrar resultados precisos. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las muestras deben canalizarse hacia arriba y hacia abajo repetidamente, idealmente utilizando puntas sin filtrar, para garantizar una lisis adecuada. Los tiempos de incubación deben seguirse como se describe. Además, transferir el 75% del lisado (en lugar del volumen total) a una placa blanca de 96 pocillos de fondo opaco para la lectura final utilizando un lector de placas ELISA permite una evaluación adecuada, ya que esto asegura el mismo volumen en cada pozo y la ausencia de burbujas de aire que se pueden introducir mediante pipeteos vigorosos.
Cabe destacar que el perfil de las respuestas farmacológicas en cultivos organoides incrustados en BME2 puede mostrar una desviación estándar más alta que la observada en cultivos de líneas celulares regulares (Figura 2, Figura 3A). La desviación estándar más alta se basa en varios factores, incluida una mayor probabilidad de variaciones menores en la siembra cuando se trabaja con BME2 y diferencias en las tasas de crecimiento de organoides individuales en los pozos durante el período de crecimiento inicial de 7 días. Por lo tanto, se deben sembrar iguales o más de cuatro réplicas técnicas por concentración de fármaco.
Lo más importante es que la presencia de células malignas portadoras de la mutación conductora oncogénica y la contaminación limitada por células epiteliales normales de las vías respiratorias deben evaluarse cuidadosamente. Los desafíos en el establecimiento del CPCNP pueden favorecer el crecimiento de las células epiteliales normales de las vías respiratorias7. El perfil del número de copias o los enfoques basados en PCR y secuenciación para confirmar la presencia de las mutaciones impulsoras oncogénicas son los métodos de elección para garantizar la calidad de los cultivos organoides de NSCLC.
Modificaciones y solución de problemas del método
Los medios y los factores de crecimiento respectivos agregados a las soluciones de medios básicos pueden afectar significativamente la respuesta de los medicamentos a los inhibidores dirigidos. Activan los receptores de derivación y las vías de señalización que influyen y limitan la respuesta al fármaco (por ejemplo, FGF, HGF, EGF)26. Si bien un medio rico en factores de crecimiento y adaptado puede ser óptimo para expandir el cultivo de organoides, las evaluaciones de la escalada de drogas y la sensibilidad deben realizarse en un medio de factor de crecimiento reducido, como se describió anteriormente. Esto se basa en la experiencia interna comparando diferentes formulaciones de medios y datos de respuesta a medicamentos (Figura 3C). Si bien las soluciones de medios pueden afectar el grado de sensibilidad a cierto tratamiento farmacológico y pueden cambiar los valores de IC50 , los fenotipos robustos de sensibilidad o resistencia son evidentes independientemente de la formulación del medio (Figura 3C, D). Además, se recomienda la consistencia general en la formulación de medios y el perfil de las respuestas farmacológicas en todos los cultivos de organoides, y se debe sembrar una igual o más de cuatro réplicas técnicas por concentración. Esto es particularmente importante para comparar los rangos en sensibilidad vs. resistencia para el Inhibidor de interés.
Limitaciones del método
El protocolo presentado aquí describe la sensibilidad de los modelos organoides de cáncer 3D NSCLC a los inhibidores dirigidos cuando se cultivan células cancerosas derivadas del paciente. Se necesitan experimentos adicionales, incluido el análisis farmacodinámico con respecto a la inhibición de la vía y el análisis de secuenciación para la presencia del oncogén impulsor y las mutaciones secundarias, para una caracterización detallada de la resistencia a los medicamentos y la sensibilidad. Además, los factores de los espectadores, como los estímulos microambientales derivados de interacciones o factores secretados por células espectadoras no cancerosas en el microambiente tumoral, no se tienen en cuenta, y se necesitan protocolos novedosos cuando se intentan modelos organoides de cocultivo con células inmunes o estromales. Trabajos recientes han destacado el uso de modelos organoides para recapitular las interacciones del microambiente tumoral y perfilar las respuestas a los inhibidores del punto de control inmunitario, como el tratamiento anti-PD-L113,31.
La importancia del método con respecto a los métodos existentes / alternativos
Los modelos organoides de cáncer 3D recapitulan la diversidad genética y los determinantes de la respuesta al tratamiento presentes en el tumor original4,5,6. En particular, la heterogeneidad espacial y temporal puede promover la evolución tumoral, y puede ocurrir la aparición paralela y el desarrollo secuencial de subclones tumorales32,33. La heterogeneidad intratumoral es significativa para la selección de células tumorales más resistentes bajo presión terapéutica9,34,35. El protocolo proporcionado aquí permite una evaluación rápida de las sensibilidades al tratamiento con inhibidores dirigidos en muestras próximas al paciente. Por lo tanto, los modelos organoides tienen ventajas sobre los modelos de líneas celulares homogéneas más convencionales que carecen de diversidad genética o estudios a largo plazo que utilizan líneas celulares o xenoinjertos derivados de pacientes. Además, el presente protocolo permite ampliar a múltiples brazos de tratamiento y enfoques de tratamiento combinado con pocas limitaciones con respecto al costo y la capacidad analítica. Como tal, agregar un segundo fármaco de interés a una dosis fija mientras se escala el inhibidor dirigido principalmente y se compara con la escalada del inhibidor dirigido principalmente solo permite evaluar de manera eficiente los posibles efectos combinatorios y con una biomasa adicional mínima requerida (Figura suplementaria 3). En comparación con las evaluaciones basadas en imágenes utilizadas para monitorear el desarrollo de organoides y la respuesta a los medicamentos, el ensayo de supervivencia celular basado en luminiscencia descrito aquí tiene una sensibilidad similar con un equipo y capacitación mínimos requeridos.
Importancia y aplicaciones potenciales del método en áreas de investigación específicas
El desarrollo de una tubería estandarizada que permita establecer modelos de organoides cancerígenos a partir de muestras de pacientes y el posterior perfil de sensibilidades a los medicamentos tiene un potencial de aplicabilidad clínica significativo. El perfil farmacológico ex vivo ha ganado reconocimiento en la detección de vulnerabilidades y características asociadas a la resistencia en tumores, correlacionándose con la respuesta al tratamiento en pacientes36,37. Significativamente, el perfil ex vivo de las sensibilidades a los medicamentos puede ayudar en la selección del tratamiento en la clínica y el diseño de tratamientos combinados racionales que aborden los mecanismos de resistencia. En general, este enfoque podría ayudar a permitir estrategias personalizadas mejoradas para la terapia molecular o los regímenes de tratamiento combinatorio. Este último puede ayudar a atacar los mecanismos de tolerancia y resistencia a los medicamentos de manera temprana y profundizar la respuesta clínica para mejorar los resultados de los pacientes en el futuro.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los laboratorios de Jeroen P Roose (UCSF) y Calvin J Kuo (Stanford) por sus aportes con respecto al cultivo de organoides y el desarrollo de protocolos. Además, agradecemos a Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) por los protocolos y la entrada del establecimiento de muestras. Este proyecto de investigación se llevó a cabo con el apoyo de los NIH [U54CA224081]. F. Haderk fue apoyado por la beca postdoctoral Mildred Scheel de la Ayuda Alemana contra el Cáncer.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |