该协议描述了NSCLC患者衍生类器官模型中靶向信号传导抑制剂药物敏感性的标准化评估。
源自临床患者标本的新型3D癌症类器官培养物是评估肿瘤内异质性和治疗对癌症靶向抑制剂的治疗反应的重要模型系统。胃肠道癌和胰腺癌的开创性工作凸显了患者源性类器官(PDO)作为患者近距离培养系统的前景,越来越多的模型正在出现。同样,其他癌症类型的工作集中在建立类器官模型和优化培养方案上。值得注意的是,3D癌症类器官模型保持了原始肿瘤标本的遗传复杂性,从而将肿瘤衍生的测序数据转化为实验环境中具有遗传信息的靶向治疗。此外,PDO可能会促进对合理联合治疗的评估,以克服未来肿瘤的耐药性相关适应。后者专注于非小细胞肺癌(NSCLC)的密集研究工作,因为耐药性的发展最终限制了靶向抑制剂的治疗成功。使用NSCLC PDO对治疗靶向机制的早期评估可能有助于为合理的联合治疗提供信息。本手稿描述了一种标准化方案,用于基于细胞培养板评估NSCLC衍生的3D PDO中靶向抑制剂的药物敏感性,具有对联合治疗和其他治疗方式的潜在适应性。
针对致癌驱动因素的个性化治疗彻底改变了癌症治疗,提高了患者生存率并减少了治疗介导的副作用1。分子诊断和测序技术的最新进展凸显了人类肿瘤的复杂性,其空间和时间异质性影响治疗反应2。长期以来,在细胞培养模型中概括这些亚克隆差异仅限于研究在其他均匀的细胞系中感兴趣的选择改变。由肿瘤活检或手术肿瘤切除产生的新开发的3D PDO模型可以改善患者衍生肿瘤组织内细胞复杂性和信号串扰的表示3。因此,源自胃肠癌和胰腺癌的肿瘤类器官已经成功生成并概括了治疗反应的遗传多样性和决定因素4,5,6。在非小细胞肺癌(NSCLC)中,类器官的发育和建立存在挑战已得到承认,并且需要优化培养技术和选择性培养基因子,以便将来更广泛,更系统地使用NSCLC PDO7,8。
开发针对经得起初始药物治疗的残留肿瘤细胞的组合疗法对于抑制耐药性发展并最终提高患者生存率至关重要9。鉴于类器官培养的结构复杂性,需要优化经典的药物反应参数,以便对药物敏感性进行准确和可重复的测试。基于成像的读数10,11 和测量细胞ATP丰度的经典细胞活力测定6,12以及其他技术可用于分析PDO培养物中的药物反应。在这里,我们开发和描述了一种标准化方案,以评估针对NSCLC PDO模型中已知临床驱动因素的靶向治疗的药物敏感性。
本手稿开发并描述了一种用于评估NSCLC衍生的3D PDO模型中药物敏感性的标准化方案。除了药物敏感性研究外,还需要进一步表征可用的类器官模型,以确定药物敏感性差异的根本原因。这可能包括类器官和患者标本的遗传分析以及可用于类器官的其他分析,例如用于分化标志物的免疫组织化学染色以及一般细胞信号传导生物标志物和生理学13,29。
协议中的关键步骤
本文概述的方案提供了一个标准化的工作流程,在仔细遵循时允许准确和可重复的药物敏感性分析。在以下步骤中应特别注意:在单细胞悬浮液生成期间消化TrypLE和DNAse I,在BME2中接种单细胞悬浮液,监测类器官生长直至治疗,培养基变化,以及在基于发光的细胞存活读数期间BME2嵌入的类器官的破坏和裂解。(1)虽然在基于TrypLE的类器官解离后额外的DNAse I消化对于在常规培养维持期间扩展类器官模型不是必需的,但在药物升级实验播种时不应省略DNAse I消化,因为它确保了将类器官簇更好地分离成单细胞悬浮液和准确的细胞计数。(2)鉴于BME2在室温下凝固,在BME2中接种单细胞悬浮液是一个关键步骤。因此,一次最多需要播种1-2行,并且在播种其他行之前应将样品放在冰上。值得注意的是,当继续接种时,需要上下移液细胞,以允许均匀的细胞悬浮液。(3)从播种到处理的7天扩增期间,需要仔细监测类器官的生长。 图1B 和 补充表1给出了预期发展的示例。值得注意的是,如图 1B 所示,通过明场显微镜和图像分析评估类器官大小的变化,可以精确评估类器官生长和倍增时间的差异。倍增时间可对药物反应产生影响,正如文献中最近讨论的那样30。如果类器官生长速率显着超过所提出的示例,则可以考虑缩短直到治疗开始的扩张时间和更短的治疗持续时间。(4)此外,更换培养基时应特别注意,以避免吸入类器官。BME2嵌入的类器官的接种位置位于6点钟位置,当板顺时针旋转180°并且培养基在类器官的相反位置被吸入时,可以安全地吸入培养基。(5)最后,在生存读数期间彻底裂解BME2包埋的类器官对于记录准确的结果至关重要。根据制造商的说明,样品应反复上下移液,最好使用未过滤的吸头,以确保适当的裂解。应按所述遵循孵育时间。此外,使用ELISA板读数器将75%的裂解物(而不是总体积)转移到白色,不透明底部的96孔板进行最终读数,可以进行适当的评估,因为这可以确保每个孔中的相同体积并且没有可以通过剧烈移液引入的气泡。
值得注意的是,BME2包埋类器官培养物中的药物反应分析可能显示比常规细胞系培养物中观察到的更高的标准偏差(图2, 图3A)。较高的标准偏差基于几个因素,包括使用BME2时播种微小变化的可能性增加,以及在最初的7天生长期内孔中单个类器官生长速率的差异。因此,应接种每个药物浓度等于或超过四个的技术重复。
最重要的是,必须仔细评估携带致癌驱动突变的恶性细胞的存在以及正常气道上皮细胞的有限污染。建立NSCLC的挑战可能有利于正常气道上皮细胞的生长7。拷贝数分析或基于PCR和测序的方法来确认是否存在致癌驱动突变是确保NSCLC类器官培养质量的首选方法。
方法的修改和故障排除
添加到基本培养基溶液中的培养基和相应的生长因子可显著影响药物对靶向抑制剂的反应。它们激活影响和限制药物反应的旁路受体和信号通路(例如,FGF,HGF,EGF)26。虽然生长因子丰富且量身定制的培养基可能是扩大类器官培养的最佳选择,但如上所述,应在减少生长因子培养基中进行药物升级和敏感性评估。这是基于比较不同培养基配方和药物反应数据的内部经验(图3C)。虽然培养基溶液可以影响对某些药物治疗的敏感性程度,并且可以改变IC50 值,但无论培养基配方如何,敏感性或耐药性的稳定表型都是显而易见的(图3C,D)。此外,建议在类器官培养物中培养基配方和分析药物反应时保持一般一致性,并且需要接种每个浓度相同或超过四个技术重复。这对于基准测试灵敏度 与对感兴趣的抑制剂的耐药性。
该方法的局限性
这里介绍的方案描述了培养患者来源的癌细胞时NSCLC 3D癌症类器官模型对靶向抑制剂的敏感性。需要进行其他实验,包括关于通路抑制的药效学分析和对驱动癌基因和继发性突变存在的测序分析,以详细表征耐药性和敏感性。此外,旁观者因素,例如来自肿瘤微环境中非癌旁观者细胞相互作用或分泌因子的微环境刺激,不考虑旁观者因素,并且在尝试与免疫或基质细胞共培养类器官模型时需要新的方案。最近的工作强调了使用类器官模型来概括肿瘤微环境相互作用和剖析对免疫检查点抑制剂(如抗PD-L1治疗)的反应13,31。
该方法相对于现有/替代方法的重要性
3D癌症类器官模型概括了原始肿瘤中存在的遗传多样性和治疗反应的决定因素4,5,6。值得注意的是,时空异质性可以促进肿瘤进化,并且肿瘤亚克隆的平行出现和顺序发展可以发生32,33。肿瘤内异质性对于在治疗压力下选择更具弹性的肿瘤细胞具有重要意义9,34,35。此处提供的方案允许快速评估患者近端样本中靶向抑制剂治疗的敏感性。因此,类器官模型比缺乏遗传多样性或使用细胞系或患者来源的异种移植物进行长期研究的更传统的同质细胞系模型具有优势。此外,目前的方案允许扩大到多个治疗组和联合治疗方法,在成本和分析能力方面几乎没有限制。因此,以固定剂量添加第二种感兴趣的药物,同时升级主要靶向抑制剂并将其与主要靶向抑制剂的单独升级进行比较,可以有效地评估潜在的组合效应,并且所需的额外生物量最少(补充图3)。与用于监测类器官发育和药物反应的基于成像的评估相比,这里描述的基于发光的细胞存活测定具有相似的灵敏度,只需最少的设备和培训。
该方法在特定研究领域的重要性和潜在应用
开发一个标准化的管道,允许从患者标本和随后的药物敏感性分析中建立癌症类器官模型,具有显着的临床适用性潜力。 离体 药理学分析在检测肿瘤中的脆弱性和耐药相关特征方面已获得认可,与患者的治疗反应相关36,37。值得注意的是,药物敏感性的 离体 分析可能有助于临床中的治疗选择和设计解决耐药机制的合理组合治疗。总体而言,这种方法可以帮助改善分子治疗或组合治疗方案的个性化策略。后者可能有助于早期靶向药物耐受性和耐药机制,并加深临床反应,以改善未来的患者预后。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢Jeroen P Roose(UCSF)和Calvin J Kuo(斯坦福大学)的实验室在类器官培养和方案开发方面的意见。我们进一步感谢Oghenekevwe M. Gbenedio(Roose实验室,UCSF)的实验方案和样本建立投入。该研究项目是在NIH [U54CA224081]的支持下进行的。F. Haderk得到了德国癌症援助组织Mildred Scheel博士后奖学金的支持。
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |