يصف هذا البروتوكول تقييما موحدا لحساسيات الأدوية لمثبطات الإشارات المستهدفة في النماذج العضوية المشتقة من المريض NSCLC.
تمثل الثقافات العضوية الجديدة للسرطان 3D المستمدة من عينات المرضى السريرية نظاما نموذجيا مهما لتقييم عدم التجانس داخل الورم واستجابة العلاج للمثبطات المستهدفة في السرطان. سلط العمل الرائد في مجال سرطانات الجهاز الهضمي والبنكرياس الضوء على وعد المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) كنظام ثقافة قريب من المريض ، مع ظهور عدد متزايد من النماذج. وبالمثل ، ركز العمل في أنواع السرطان الأخرى على إنشاء نماذج عضوية وتحسين بروتوكولات الثقافة. والجدير بالذكر أن النماذج العضوية للسرطان 3D تحافظ على التعقيد الجيني لعينات الورم الأصلية وبالتالي تترجم بيانات التسلسل المشتقة من الورم إلى علاج باستخدام علاجات مستهدفة مستنيرة وراثيا في بيئة تجريبية. وعلاوة على ذلك، قد تعزز شركات تنمية نفط عمان تقييم العلاجات المركبة العقلانية للتغلب على التكيف المرتبط بالمقاومة للأورام في المستقبل. يركز هذا الأخير على الجهود البحثية المكثفة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) ، حيث أن تطوير المقاومة يحد في النهاية من نجاح علاج المثبطات المستهدفة. يمكن أن يساعد التقييم المبكر للآليات القابلة للاستهداف علاجيا باستخدام NSCLC PDOs في إثراء العلاجات المركبة العقلانية. تصف هذه المخطوطة بروتوكولا موحدا للتقييم القائم على لوحة زراعة الخلايا لحساسيات الأدوية للمثبطات المستهدفة في PDOs 3D المشتقة من NSCLC ، مع القدرة المحتملة على التكيف مع العلاجات التوليفية وطرائق العلاج الأخرى.
أحدثت العلاجات الشخصية ضد السائقين المصابين بالأورام ثورة في علاج السرطان، مما أدى إلى تحسين بقاء المريض على قيد الحياة والحد من الآثار الجانبية بوساطة العلاج1. وقد سلطت التطورات الحديثة في التشخيص الجزيئي وتقنيات التسلسل الضوء على تعقيد الأورام البشرية، مع عدم التجانس المكاني والزماني الذي يؤثر على الاستجابة للعلاج2. لطالما اقتصر تلخيص هذه الاختلافات تحت النسيلية في نماذج زراعة الخلايا على التحقيق في التغييرات المختارة ذات الأهمية في خطوط الخلايا الموحدة. تسمح نماذج شركة تنمية نفط عمان ثلاثية الأبعاد المطورة حديثا الناتجة عن خزعات الورم أو عمليات استئصال الورم الجراحية بتحسين تمثيل التعقيد الخلوي والتحدث المتبادل داخل أنسجة الورم المشتقة من المريض3. على هذا النحو ، تم بنجاح توليد الأورام العضوية المشتقة من سرطان الجهاز الهضمي والبنكرياس وتلخيص التنوع الجيني ومحددات استجابة العلاج4،5،6. في سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) ، يتم الاعتراف بتحديات التطوير والتأسيس العضوية ، وهناك حاجة إلى تحسين تقنيات الزراعة وعوامل الوسائط الانتقائية لتمكين الاستخدام الأوسع والأكثر منهجية ل NSCLC PDOs في المستقبل7,8.
يعد تطوير علاجات توافقية تستهدف الخلايا السرطانية المتبقية التي تتحمل العلاج الدوائي الأولي أمرا ضروريا لمنع تطور المقاومة وفي نهاية المطاف لتحسين بقاء المريض على قيد الحياة9. ونظرا للتعقيد المعماري للثقافات العضوية، يلزم تحسين بارامترات الاستجابة للعقاقير الكلاسيكية للسماح بإجراء اختبارات دقيقة وقابلة للتكرار لحساسيات العقاقير. تتوفر القراءات القائمة على التصوير10,11 واختبارات جدوى الخلايا الكلاسيكية التي تقيس وفرة ATP الخلوية6,12، من بين تقنيات أخرى، لتحديد ملامح الاستجابات الدوائية في مزارع شركة تنمية نفط عمان. هنا ، نقوم بتطوير ووصف بروتوكول موحد لتقييم الحساسية الدوائية للعلاج المستهدف ضد الدوافع السريرية المعروفة في نماذج NSCLC PDO.
تطور هذه المخطوطة وتصف بروتوكولا موحدا لتقييم حساسية الدواء في نماذج 3D PDO المشتقة من NSCLC. بالإضافة إلى دراسات حساسية الدواء ، هناك حاجة إلى مزيد من التوصيف للنماذج العضوية المتاحة لتحديد الأسباب الكامنة وراء الاختلافات في حساسية الدواء. وقد يشمل ذلك التنميط الجيني للعضويات وعينات المرضى وغيرها من التحليلات المتاحة للعضويات، مثل تلطيخ الكيمياء النسيجية المناعية لعلامات التمايز والمؤشرات الحيوية العامة للإشارات الخلوية وعلم وظائف الأعضاء13،29.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يوفر البروتوكول الموضح هنا سير عمل موحدا يسمح بإجراء تحليلات دقيقة وقابلة للتكرار لحساسية الدواء عند اتباعها بعناية. يجب توخي الحذر بشكل خاص في الخطوات التالية: هضم TrypLE و DNAse I أثناء توليد معلقات أحادية الخلية ، وبذر معلقات الخلية الواحدة في BME2 ، ومراقبة نمو الأعضاء حتى العلاج ، وتغيرات الوسائط ، وتعطيل وتحلل المواد العضوية المضمنة BME2 أثناء قراءة بقاء الخلايا القائمة على التلألؤ. (1) في حين أن الهضم الإضافي للحمض النووي I بعد التفكك القائم على التربيل للعضويات ليس ضروريا لتوسيع النماذج العضوية أثناء الصيانة المنتظمة للزراعة ، لا ينبغي حذف هضم الحمض النووي I عند البذر لتجارب تصعيد الأدوية لأنه يضمن فصلا أفضل للمجموعات العضوية إلى معلقات أحادية الخلية وإحصاء دقيق للخلايا. (2) يمثل بذر التعليق أحادي الخلية في BME2 خطوة حاسمة بالنظر إلى تصلب BME2 في درجة حرارة الغرفة. وبالتالي ، يجب زرع 1-2 صفوف كحد أقصى في وقت واحد ، ويجب وضع العينات على الجليد قبل زرع صفوف إضافية. تجدر الإشارة إلى أن الخلايا تحتاج إلى ماصة لأعلى ولأسفل عند استمرار البذر للسماح بتعليق الخلايا المتجانسة. (3) يجب مراقبة النمو العضوي بعناية أثناء التوسع لمدة 7 أيام من البذر إلى العلاج. ويرد مثال على التطور المتوقع في الشكل 1 باء والجدول التكميلي 1. وتجدر الإشارة إلى أن تقييم التغيرات في حجم العضوية بواسطة الفحص المجهري الساطع وتحليل الصور كما هو موضح في الشكل 1B قد يسمح بإجراء تقييم دقيق للاختلافات في نمو الأعضاء ومضاعفة الأوقات. ويمكن أن يكون لمضاعفة الأوقات تأثير على الاستجابات للأدوية، كما نوقش مؤخرا في الأدبيات30. إذا تجاوز معدل النمو العضوي المثال المقدم بشكل كبير ، فيمكن النظر في وقت توسع أقصر حتى بدء العلاج ومدة علاج أقصر. (4) بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي توخي الحذر بشكل خاص عند تغيير الوسائط لتجنب شفط المواد العضوية. يسمح موضع البذر للعضويات المدمجة BME2 في موضع الساعة 6 بطموح آمن للوسائط عندما يتم تدوير الألواح في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 180 درجة ويتم شفط الوسائط في الموضع المعاكس للعضويات. (5) أخيرا ، يعد التحلل الشامل للعضويات المضمنة في BME2 أثناء قراءة البقاء على قيد الحياة أمرا ضروريا لتسجيل نتائج دقيقة. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يجب سحب العينات لأعلى ولأسفل بشكل متكرر ، من الناحية المثالية باستخدام نصائح غير مفلترة ، لضمان التحلل المناسب. يجب اتباع أوقات الحضانة كما هو موضح. علاوة على ذلك ، فإن نقل 75٪ من الليزات (بدلا من الحجم الكلي) إلى لوحة 96 بئرا بيضاء غير شفافة القاع للقراءة النهائية باستخدام قارئ لوحة ELISA يسمح بإجراء تقييم مناسب ، لأن هذا يضمن نفس الحجم في كل بئر وعدم وجود فقاعات هواء يمكن إدخالها عن طريق السحب القوي.
وتجدر الإشارة إلى أن توصيف الاستجابات الدوائية في المزارع العضوية المضمنة في BME2 قد يظهر انحرافا معياريا أعلى مما لوحظ في مزارع خطوط الخلايا العادية (الشكل 2، الشكل 3A). يعتمد الانحراف المعياري الأعلى على عدة عوامل ، بما في ذلك زيادة احتمال حدوث اختلافات طفيفة في البذر عند العمل مع BME2 والاختلافات في معدلات النمو العضوية الفردية عبر الآبار خلال فترة النمو الأولية لمدة 7 أيام. وبالتالي ، ينبغي زرع ما يساوي أو يزيد عن أربعة تكرارات تقنية لكل تركيز دوائي.
الأهم من ذلك ، يجب تقييم وجود خلايا خبيثة تحمل طفرة المحرك الورمي والتلوث المحدود بالخلايا الظهارية الطبيعية في مجرى الهواء بعناية. يمكن للتحديات في إنشاء NSCLC أن تفضل نمو الخلايا الظهارية الطبيعية في مجرى الهواء 7. إن تحديد ملامح رقم النسخ أو النهج القائمة على PCR والتسلسل لتأكيد وجود طفرات المحرك الورمي هي الطرق المفضلة لضمان جودة ثقافات NSCLC العضوية.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الطريقة
يمكن أن تؤثر وسائل الإعلام وعوامل النمو ذات الصلة المضافة إلى حلول الوسائط الأساسية بشكل كبير على استجابة الدواء للمثبطات المستهدفة. فهي تنشط مستقبلات الالتفافية ومسارات الإشارات التي تؤثر على الاستجابة للأدوية وتحد منها (على سبيل المثال، FGF، HGF، EGF)26. في حين أن الوسائط الغنية بعوامل النمو والمصممة خصيصا قد تكون مثالية لتوسيع الثقافة العضوية ، يجب إجراء تقييمات تصعيد الأدوية والحساسية في وسائط منخفضة عوامل النمو ، كما هو موضح أعلاه. ويستند ذلك إلى الخبرة الداخلية التي تقارن بين مختلف تركيبات الوسائط وبيانات الاستجابة للعقاقير (الشكل 3 جيم). في حين أن حلول الوسائط يمكن أن تؤثر على درجة الحساسية لبعض العلاجات الدوائية ويمكن أن تغير قيم IC50 ، فإن الأنماط الظاهرية القوية للحساسية أو المقاومة واضحة بغض النظر عن تركيبة الوسائط (الشكل 3C ، D). وبالإضافة إلى ذلك، يوصى بالاتساق العام في صياغة وسائط الإعلام وتحديد ملامح الاستجابات الدوائية عبر الثقافات العضوية، ويلزم زرع ما يعادل أو يزيد عن أربعة تكرارات تقنية لكل تركيز. هذا مهم بشكل خاص لقياس النطاقات في الحساسية مقابل. مقاومة لمثبط الفائدة.
قيود الطريقة
يصف البروتوكول المعروض هنا حساسية نماذج NSCLC 3D العضوية للسرطان للمثبطات المستهدفة عند زراعة الخلايا السرطانية المشتقة من المريض. وهناك حاجة إلى تجارب إضافية، بما في ذلك التحليل الدوائي الديناميكي فيما يتعلق بتثبيط المسار وتحليل التسلسل لوجود الجين الورمي المحرك والطفرات الثانوية، من أجل توصيف مفصل لمقاومة الأدوية وحساسيتها. علاوة على ذلك ، لا يتم حساب العوامل المتفرجة مثل المحفزات البيئية الدقيقة المشتقة من التفاعلات أو العوامل المفرزة من قبل الخلايا المتفرجة غير السرطانية في البيئة الدقيقة للورم ، وهناك حاجة إلى بروتوكولات جديدة عند محاولة نماذج العضوية المشتركة مع الخلايا المناعية أو اللحمية . وقد سلط العمل الأخير الضوء على استخدام النماذج العضوية لتلخيص تفاعلات البيئة الدقيقة للورم واستجابات الملف الشخصي لمثبطات نقاط التفتيش المناعية ، مثل العلاج المضاد ل PD-L1 13,31.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق الحالية / البديلة
تلخص النماذج العضوية للسرطان ثلاثي الأبعاد التنوع الجيني ومحددات استجابة العلاج الموجودة في الورم الأصلي4,5,6. ومن الجدير بالذكر أن عدم التجانس المكاني والزماني يمكن أن يعزز تطور الورم، ويمكن أن يحدث ظهور مواز وتطور متسلسل للنسخ الفرعية للورم32,33. عدم التجانس داخل الورم مهم لاختيار الخلايا السرطانية الأكثر مرونة تحت الضغط العلاجي9،34،35. يسمح البروتوكول المقدم هنا بإجراء تقييم سريع للحساسيات للعلاج باستخدام مثبطات مستهدفة في عينات قريبة من المريض. وبالتالي ، فإن النماذج العضوية لها مزايا على نماذج خطوط الخلايا المتجانسة التقليدية التي تفتقر إلى التنوع الجيني أو الدراسات طويلة الأجل باستخدام خطوط الخلايا أو xenografts المشتقة من المريض. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول بالتوسع إلى أذرع متعددة من العلاج ونهج العلاج المختلط مع قيود قليلة فيما يتعلق بالتكلفة والقدرة التحليلية. وعلى هذا النحو، فإن إضافة دواء ثان ذي أهمية بجرعة ثابتة مع تصعيد المثبط المستهدف في المقام الأول ومقارنته بتصعيد المثبط المستهدف في المقام الأول وحده يسمح بتقييم الآثار التوافقية المحتملة بكفاءة مع الحد الأدنى من الكتلة الحيوية الإضافية المطلوبة (الشكل التكميلي 3). بالمقارنة مع التقييمات القائمة على التصوير المستخدمة لمراقبة تطور المواد العضوية والاستجابة للعقاقير ، فإن اختبار بقاء الخلايا القائم على التلألؤ الموصوف هنا له حساسية مماثلة مع الحد الأدنى من المعدات والتدريب المطلوب.
أهمية والتطبيقات المحتملة للطريقة في مجالات بحثية محددة
إن تطوير خط أنابيب موحد يسمح بإنشاء نماذج عضوية للسرطان من عينات المرضى ، ويحمل التنميط الحساس للأدوية اللاحقة إمكانات تطبيق سريرية كبيرة. اكتسب التنميط الدوائي خارج الجسم الحي اعترافا في الكشف عن نقاط الضعف والميزات المرتبطة بالمقاومة في الأورام ، والتي ترتبط باستجابة العلاج لدى المرضى36,37. ومن الجدير بالذكر أن التنميط خارج الجسم الحي لحساسيات الأدوية قد يساعد في اختيار العلاج في العيادة وتصميم علاجات توليفية عقلانية تعالج آليات المقاومة. بشكل عام ، يمكن أن يساعد هذا النهج في تمكين استراتيجيات شخصية محسنة للعلاج الجزيئي أو أنظمة العلاج التوافقي. وقد يساعد هذا الأخير في استهداف آليات تحمل الأدوية ومقاومتها في وقت مبكر وتعميق الاستجابة السريرية لتحسين نتائج المرضى في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
نشكر مختبرات Jeroen P Roose (UCSF) و Calvin J Kuo (Stanford) على مدخلاتهم فيما يتعلق بالثقافة العضوية وتطوير البروتوكول. كما نشكر Oghenekevwe M. Gbenedio (مختبر Roose ، UCSF) على البروتوكولات ومدخلات إنشاء العينات. تم إجراء هذا المشروع البحثي بدعم من المعاهد الوطنية للصحة [U54CA224081]. حصل F. Haderk على دعم زمالة Mildred Scheel لما بعد الدكتوراه من المعونة الألمانية للسرطان.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |