Questo protocollo descrive una valutazione standardizzata della sensibilità dei farmaci agli inibitori di segnalazione mirati in modelli di organoidi derivati dal paziente NSCLC.
Nuove colture organoidi tumorali 3D derivate da campioni di pazienti clinici rappresentano un importante sistema modello per valutare l’eterogeneità intratumorale e la risposta al trattamento agli inibitori mirati nel cancro. Il lavoro pionieristico nei tumori gastrointestinali e pancreatici ha evidenziato la promessa di organoidi derivati dal paziente (DOP) come sistema di coltura prossima al paziente, con un numero crescente di modelli emergenti. Allo stesso modo, il lavoro in altri tipi di cancro si è concentrato sulla creazione di modelli organoidi e sull’ottimizzazione dei protocolli di coltura. In particolare, i modelli organoidi tumorali 3D mantengono la complessità genetica dei campioni tumorali originali e quindi traducono i dati di sequenziamento derivati dal tumore in trattamento con terapie mirate geneticamente informate in un ambiente sperimentale. Inoltre, le DOP potrebbero favorire la valutazione di trattamenti combinati razionali per superare l’adattamento associato alla resistenza dei tumori in futuro. Quest’ultimo si concentra su intensi sforzi di ricerca nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), poiché lo sviluppo della resistenza alla fine limita il successo del trattamento degli inibitori mirati. Una valutazione precoce dei meccanismi terapeuticamente mirabili utilizzando NSCLC DOP potrebbe aiutare a informare i trattamenti combinati razionali. Questo manoscritto descrive un protocollo standardizzato per la valutazione basata su piastre di coltura cellulare della sensibilità dei farmaci agli inibitori mirati nelle DOP 3D derivate da NSCLC, con potenziale adattabilità a trattamenti combinati e altre modalità di trattamento.
Le terapie personalizzate contro i driver oncogeni hanno rivoluzionato il trattamento del cancro, migliorando la sopravvivenza dei pazienti e riducendo gli effetti collaterali mediati dal trattamento1. I recenti progressi nella diagnostica molecolare e nelle tecnologie di sequenziamento hanno evidenziato la complessità dei tumori umani, con l’eterogeneità spaziale e temporale che influisce sulla risposta al trattamento2. La ricapitolazione di queste differenze subclonali nei modelli di coltura cellulare è stata a lungo limitata allo studio di alterazioni selezionate di interesse in linee cellulari altrimenti uniformi. I modelli DOP 3D di recente sviluppo generati da biopsie tumorali o resezioni chirurgiche del tumore consentono una migliore rappresentazione della complessità cellulare e della diafonia di segnalazione all’interno del tessuto tumorale derivato dal paziente3. Pertanto, gli organoidi tumorali derivati dal cancro gastrointestinale e pancreatico sono stati generati con successo e ricapitolano la diversità genetica e i determinanti della risposta al trattamento4,5,6. Nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), le sfide dello sviluppo e dell’insediamento di organoidi sono riconosciute e l’ottimizzazione delle tecniche di coltura e dei fattori selettivi dei mezzi è necessaria per consentire un uso più ampio e sistematico delle DOP NSCLC in futuro7,8.
Lo sviluppo di terapie combinatorie mirate alle cellule tumorali residue che resistono al trattamento farmacologico iniziale è essenziale per inibire lo sviluppo della resistenza e, in ultima analisi, per migliorare la sopravvivenza del paziente9. Data la complessità architettonica delle colture organoidiche, i parametri classici di risposta ai farmaci devono essere ottimizzati per consentire test accurati e riproducibili della sensibilità ai farmaci. Letture basate sull’imaging10,11 e saggi di vitalità cellulare classici che misurano l’abbondanza di ATP cellulare6,12, tra le altre tecniche, sono disponibili per profilare le risposte ai farmaci nelle colture DOP. Qui, sviluppiamo e descriviamo un protocollo standardizzato per valutare la sensibilità dei farmaci alla terapia mirata rispetto a driver clinici noti in modelli NSCLC PDO.
Questo manoscritto sviluppa e descrive un protocollo standardizzato per la valutazione della sensibilità ai farmaci in modelli DOP 3D derivati da NSCLC. Oltre agli studi di sensibilità ai farmaci, è necessaria un’ulteriore caratterizzazione dei modelli organoidi disponibili per determinare le cause alla base delle differenze nella sensibilità ai farmaci. Ciò può includere la profilazione genetica di organoidi e campioni di pazienti e altre analisi disponibili per gli organoidi, come la colorazione immunoistochimica per i marcatori di differenziazione e i biomarcatori e la fisiologia generali di segnalazione cellulare13,29.
Passaggi critici nel protocollo
Il protocollo qui delineato fornisce un flusso di lavoro standardizzato che consente analisi accurate e riproducibili della sensibilità ai farmaci se seguite attentamente. Particolare attenzione deve essere prestata nelle seguenti fasi: digestione di TrypLE e DNAse I durante la generazione di sospensioni monocellulari, semina di sospensioni monocellulari in BME2, monitoraggio della crescita organoide fino al trattamento, cambiamenti dei media e interruzione e lisi degli organoidi incorporati BME2 durante la lettura della sopravvivenza cellulare basata sulla luminescenza. (1) Mentre la digestione aggiuntiva di DNAse I dopo la dissociazione degli organoidi basata su TrypLE non è essenziale per espandere i modelli organoidi durante il regolare mantenimento della coltura, la digestione della DNAse I non dovrebbe essere omessa quando si semina per esperimenti di escalation di farmaci in quanto garantisce una migliore separazione dei cluster organoidi in sospensioni monocellulari e un accurato conteggio cellulare. (2) La semina di sospensioni monocellulari in BME2 rappresenta un passo critico data la solidificazione di BME2 a temperatura ambiente. Pertanto, un massimo di 1-2 file deve essere seminato contemporaneamente e i campioni devono essere posti sul ghiaccio prima che vengano seminate ulteriori file. Da notare, le cellule devono essere pipettate su e giù quando si continua la semina per consentire una sospensione cellulare omogenea. (3) La crescita degli organoidi deve essere monitorata attentamente durante l’espansione di 7 giorni dalla semina al trattamento. Un esempio dello sviluppo previsto è riportato nella figura 1B e nella tabella supplementare 1. Da notare, la valutazione dei cambiamenti nelle dimensioni degli organoidi mediante microscopia a campo luminoso e analisi delle immagini come presentato nella Figura 1B può consentire una valutazione precisa delle differenze nella crescita degli organoidi e nei tempi di raddoppio. I tempi di raddoppio possono avere un impatto sulle risposte ai farmaci, come recentemente discusso in letteratura30. Se il tasso di crescita degli organoidi supera significativamente l’esempio presentato, si può prendere in considerazione un tempo di espansione più breve fino all’inizio del trattamento e una durata del trattamento più breve. (4) Inoltre, si deve prestare particolare attenzione quando si cambiano i fluidi per evitare l’aspirazione di organoidi. La posizione di semina degli organoidi incorporati BME2 a ore 6 consente un’aspirazione sicura del fluido quando le piastre vengono ruotate in senso orario di 180 ° e il fluido viene aspirato nella posizione opposta degli organoidi. (5) Infine, la lisi completa degli organoidi incorporati in BME2 durante la lettura della sopravvivenza è essenziale per registrare risultati accurati. Secondo le istruzioni del produttore, i campioni devono essere pipettati su e giù ripetutamente, idealmente utilizzando punte non filtrate, per garantire una corretta lisi. I tempi di incubazione devono essere seguiti come descritto. Inoltre, il trasferimento del 75% del lisato (anziché del volume totale) su una piastra bianca a fondo opaco a 96 pozzetti per la lettura finale utilizzando un lettore di piastre ELISA consente una valutazione appropriata, in quanto ciò garantisce lo stesso volume in ciascun pozzetto e l’assenza di bolle d’aria che possono essere introdotte mediante un vigoroso pipettaggio.
Da notare, la profilazione delle risposte ai farmaci in colture organoidiche incorporate in BME2 può mostrare una deviazione standard più elevata rispetto a quella osservata nelle colture cellulari regolari (Figura 2, Figura 3A). La deviazione standard più elevata si basa su diversi fattori, tra cui una maggiore probabilità di piccole variazioni nella semina quando si lavora con BME2 e differenze nei tassi di crescita dei singoli organoidi tra i pozzi nel periodo di crescita iniziale di 7 giorni. Pertanto, dovrebbero essere seminate uguali o più di quattro repliche tecniche per concentrazione di farmaco.
Ancora più importante, la presenza di cellule maligne portatrici della mutazione del driver oncogenico e la contaminazione limitata da parte delle normali cellule epiteliali delle vie aeree devono essere attentamente valutate. Le sfide nella costituzione di NSCLC possono favorire la crescita delle normali cellule epiteliali delle vie aeree7. Il profilo del numero di copia o gli approcci basati sulla PCR e sul sequenziamento per confermare la presenza delle mutazioni del driver oncogenico sono i metodi di scelta per garantire la qualità delle colture organoidiche NSCLC.
Modifiche e risoluzione dei problemi del metodo
I media e i rispettivi fattori di crescita aggiunti alle soluzioni multimediali di base possono avere un impatto significativo sulla risposta dei farmaci agli inibitori mirati. Attivano i recettori di bypass e le vie di segnalazione che influenzano e limitano la risposta ai farmaci (ad esempio, FGF, HGF, EGF)26. Mentre un fattore di crescita ricco e su misura può essere ottimale per espandere la coltura di organoidi, l’escalation dei farmaci e le valutazioni della sensibilità dovrebbero essere eseguite in un mezzo a fattore di crescita ridotto, come descritto sopra. Ciò si basa sull’esperienza interna che confronta diverse formulazioni dei media e dati sulla risposta ai farmaci (Figura 3C). Mentre le soluzioni multimediali possono influenzare il grado di sensibilità a determinati trattamenti farmacologici e possono spostare i valori IC50 , fenotipi robusti di sensibilità o resistenza sono evidenti indipendentemente dalla formulazione dei media (Figura 3C, D). Inoltre, si raccomanda una coerenza generale nella formulazione dei mezzi e la profilazione delle risposte ai farmaci tra le colture organoidiche e devono essere seminate una replica tecnica uguale o superiore a quattro per concentrazione. Ciò è particolarmente importante per confrontare gli intervalli di sensibilità rispetto a. resistenza per l’Inibitore di interesse.
Limitazioni del metodo
Il protocollo qui presentato descrive la sensibilità dei modelli organoidi del cancro NSCLC 3D agli inibitori mirati quando vengono coltivate cellule tumorali derivate dal paziente. Ulteriori esperimenti, tra cui l’analisi farmacodinamica riguardante l’inibizione della via e l’analisi di sequenziamento per la presenza dell’oncogene driver e delle mutazioni secondarie, sono necessari per una caratterizzazione dettagliata della resistenza e della sensibilità ai farmaci. Inoltre, i fattori degli astanti come gli stimoli microambientali derivati da interazioni o fattori secreti da cellule non tumorali nel microambiente tumorale non sono presi in considerazione e sono necessari nuovi protocolli quando si tentano modelli organoidi di co-coltura con cellule immunitarie o stromali. Recenti lavori hanno evidenziato l’uso di modelli organoidi per ricapitolare le interazioni del microambiente tumorale e profilare le risposte agli inibitori del checkpoint immunitario, come il trattamento anti-PD-L113,31.
Il significato del metodo rispetto ai metodi esistenti / alternativi
I modelli organoidi 3D del cancro ricapitolano la diversità genetica e i determinanti della risposta al trattamento presenti nel tumore originale4,5,6. In particolare, l’eterogeneità spaziale e temporale può promuovere l’evoluzione del tumore e possono verificarsi l’emergenza parallela e lo sviluppo sequenziale di sottocloni tumorali32,33. L’eterogeneità intratumorale è significativa per la selezione di cellule tumorali più resilienti sotto pressione terapeutica9,34,35. Il protocollo qui fornito consente una rapida valutazione della sensibilità al trattamento con inibitori mirati in campioni vicini al paziente. Pertanto, i modelli organoidi presentano vantaggi rispetto ai modelli di linee cellulari omogenee più convenzionali privi di diversità genetica o studi a lungo termine che utilizzano linee cellulari o xenotrapianti derivati dal paziente. Inoltre, il presente protocollo consente di scalare fino a più bracci di trattamento e approcci di trattamento combinato con poche limitazioni per quanto riguarda i costi e la capacità analitica. Pertanto, l’aggiunta di un secondo farmaco di interesse a una dose fissa mentre si intensifica l’inibitore principalmente mirato e lo si confronta con l’escalation dell’inibitore principalmente mirato da solo consente di valutare in modo efficiente i potenziali effetti combinatori e con una biomassa aggiuntiva minima richiesta (Figura supplementare 3). Rispetto alle valutazioni basate sull’imaging utilizzate per monitorare lo sviluppo di organoidi e la risposta ai farmaci, il test di sopravvivenza cellulare basato sulla luminescenza qui descritto ha una sensibilità simile con attrezzature e formazione minimi richiesti.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo in specifiche aree di ricerca
Lo sviluppo di una pipeline standardizzata che consenta di stabilire modelli organoidi di cancro da campioni di pazienti e il successivo profilo di sensibilità ai farmaci ha un significativo potenziale di applicabilità clinica. Il profilo farmacologico ex vivo ha ottenuto riconoscimenti nel rilevare vulnerabilità e caratteristiche resistenti associate nei tumori, in correlazione con la risposta al trattamento nei pazienti36,37. Significativamente, la profilazione ex vivo delle sensibilità ai farmaci può aiutare nella selezione del trattamento in clinica e nella progettazione di trattamenti combinati razionali che affrontano i meccanismi di resistenza. Nel complesso, questo approccio potrebbe aiutare a migliorare le strategie personalizzate per la terapia molecolare o i regimi di trattamento combinatorio. Quest’ultimo può aiutare a indirizzare precocemente i meccanismi di tolleranza e resistenza ai farmaci e approfondire la risposta clinica per migliorare i risultati dei pazienti in futuro.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i laboratori di Jeroen P Roose (UCSF) e Calvin J Kuo (Stanford) per il loro contributo alla coltura organoide e allo sviluppo del protocollo. Ringraziamo inoltre Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) per i protocolli e l’input di creazione del campione. Questo progetto di ricerca è stato condotto con il supporto del NIH [U54CA224081]. F. Haderk è stato sostenuto dalla borsa di studio post-dottorato Mildred Scheel del German Cancer Aid.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |