Este protocolo descreve uma avaliação padronizada da sensibilidade medicamentosa a inibidores de sinalização direcionados em modelos organoides derivados do paciente NSCLC.
Novas culturas organoides de câncer 3D derivadas de amostras clínicas de pacientes representam um importante sistema modelo para avaliar a heterogeneidade intratumor e a resposta ao tratamento a inibidores direcionados no câncer. O trabalho pioneiro em cânceres gastrointestinais e pancreáticos destacou a promessa de organoides derivados do paciente (PDOs) como um sistema de cultura proximate do paciente, com um número crescente de modelos emergindo. Da mesma forma, o trabalho em outros tipos de câncer tem focado no estabelecimento de modelos organoides e na otimização de protocolos culturais. Notavelmente, os modelos organoides de câncer 3D mantêm a complexidade genética dos espécimes originais do tumor e, assim, traduzem dados de sequenciamento derivados do tumor em tratamento com terapias-alvo geneticamente informadas em um ambiente experimental. Além disso, os PDOs podem fomentar a avaliação de tratamentos de combinação racional para superar a adaptação associada à resistência dos tumores no futuro. Este último se concentra em intensos esforços de pesquisa em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), pois o desenvolvimento de resistência limita o sucesso do tratamento de inibidores direcionados. Uma avaliação precoce dos mecanismos terapeuticamente direcionados usando PDOs NSCLC poderia ajudar a informar tratamentos de combinação racional. Este manuscrito descreve um protocolo padronizado para a avaliação baseada em placas de cultura celular de sensibilidades medicamentosas a inibidores direcionados em PDOs 3D derivados do NSCLC, com potencial adaptabilidade a tratamentos combinados e outras modalidades de tratamento.
Terapias personalizadas contra motoristas oncogênicos revolucionaram o tratamento do câncer, melhorando a sobrevivência do paciente e reduzindo os efeitos colaterais mediados pelo tratamento1. Os recentes avanços nas tecnologias de diagnóstico molecular e sequenciamento têm destacado a complexidade dos tumores humanos, com heterogeneidade espacial e temporal impactando a resposta ao tratamento2. Recapitulando essas diferenças subclonais nos modelos de cultura celular tem sido limitado a investigar alterações selecionadas de interesse em linhas celulares uniformes. Modelos de PDO 3D recém-desenvolvidos gerados a partir de biópsias tumorais ou ressecções tumorais cirúrgicas permitem uma melhor representação da complexidade celular e sinalização de crosstalk dentro do tecido tumoral derivado do paciente3. Como tal, organoides tumorais derivados do câncer gastrointestinal e pancreático foram gerados com sucesso e recapitulam a diversidade genética e os determinantes da resposta ao tratamento4,5,6. No câncer de pulmão não-pequeno celular (NSCLC), os desafios de desenvolvimento organoide e estabelecimento são reconhecidos, e a otimização de técnicas de cultura e fatores de mídia seletivas é necessária para permitir o uso mais amplo e sistemático de PDOs NSCLC no futuro7,8.
Desenvolver terapias combinatórias direcionadas às células tumorais residuais que resistem ao tratamento medicamentoso inicial é essencial para inibir o desenvolvimento da resistência e, em última instância, melhorar a sobrevivência do paciente9. Dada a complexidade arquitetônica das culturas organoides, os parâmetros clássicos de resposta a drogas precisam ser otimizados para permitir testes precisos e reprodutíveis de sensibilidades medicamentosas. Leituras baseadas em imagens10,11 e ensaios de viabilidade celular clássica que medem a abundância de ATP celular6,12, entre outras técnicas, estão disponíveis para perfilar respostas de medicamentos nas culturas de PDO. Aqui, desenvolvemos e descrevemos um protocolo padronizado para avaliar sensibilidades medicamentosas à terapia direcionada contra motoristas clínicos conhecidos em modelos PDO NSCLC.
Este manuscrito desenvolve e descreve um protocolo padronizado para avaliar a sensibilidade medicamentosa em modelos PDO 3D derivados do NSCLC. Além dos estudos de sensibilidade a medicamentos, é necessária uma caracterização adicional dos modelos organoides disponíveis para determinar as causas subjacentes às diferenças na sensibilidade medicamentosa. Isso pode incluir o perfil genético de organoides e amostras de pacientes e outras análises disponíveis para organoides, como a coloração imunohistoquímica para marcadores de diferenciação e biomarcadores de sinalização celular geral e fisiologia13,29.
Passos críticos no protocolo
O protocolo aqui descrito fornece um fluxo de trabalho padronizado que permite análises precisas e reprodutíveis de sensibilidade a medicamentos quando seguidos cuidadosamente. Deve-se tomar cuidado especial nas seguintes etapas: Digestão trypLE e DNAse I durante a geração de suspensões unicelulares, semeadura de suspensões unicelulares no BME2, monitoramento do crescimento organoide até o tratamento, alterações na mídia e interrupção e lise de organoides incorporados BME2 durante a leitura de células baseadas em luminescência. (1) Embora a digestão adicional de DNAse I após a dissociação de organoides baseada em TrypLE não seja essencial para a expansão de modelos organoides durante a manutenção regular da cultura, a digestão DNAse I não deve ser omitida ao semear experimentos de escalonamento de drogas, pois garante uma melhor separação dos aglomerados organoides em suspensões unicelulares e contagem precisa de células. (2) A semeadura da suspensão unicelular no BME2 representa um passo crítico dada a solidificação do BME2 à temperatura ambiente. Assim, um máximo de 1-2 linhas precisa ser semeado de uma só vez, e as amostras devem ser colocadas no gelo antes que linhas adicionais sejam semeadas. Note-se que as células precisam ser es tubos para cima e para baixo quando a semeadura é continuada para permitir uma suspensão celular homogênea. (3) O crescimento organoide precisa ser monitorado cuidadosamente durante a expansão de 7 dias da semeadura para o tratamento. Um exemplo do desenvolvimento esperado é dado na Figura 1B e Na Tabela Suplementar 1. Note-se que avaliar alterações no tamanho organoide por microscopia de campo brilhante e análise de imagem apresentada na Figura 1B pode permitir uma avaliação precisa das diferenças no crescimento organoide e dos tempos de duplicação. Dobrar tempos pode ter impacto nas respostas a medicamentos, como discutido recentemente na literatura30. Se a taxa de crescimento organoide exceder significativamente o exemplo apresentado, pode-se considerar um menor tempo de expansão até o início do tratamento e menor duração do tratamento. (4) Além disso, deve-se tomar cuidado especial ao mudar a mídia para evitar a aspiração de organoides. A posição de semeadura dos organoides incorporados BME2 na posição das 6 horas permite uma aspiração segura da mídia quando as placas são viradas no sentido horário por 180° e a mídia é aspirada na posição oposta dos organoides. (5) Finalmente, a lise completa dos organoides incorporados BME2 durante a leitura de sobrevivência é essencial para registrar resultados precisos. De acordo com as instruções do fabricante, as amostras devem ser escoadas para cima e para baixo repetidamente, idealmente usando pontas não filtradas, para garantir a lise adequada. Os tempos de incubação devem ser seguidos como descrito. Além disso, transferir 75% do lisato (em vez do volume total) para uma placa branca, de fundo opaco de 96 poços para a leitura final usando um leitor de placa ELISA permite uma avaliação adequada, pois isso garante o mesmo volume em cada poço e a ausência de bolhas de ar que podem ser introduzidas por tubulação vigorosa.
Note-se que o perfil das respostas de medicamentos nas culturas organoides incorporadas ao BME2 pode mostrar um desvio padrão maior do que o observado nas culturas regulares da linha celular (Figura 2, Figura 3A). O maior desvio padrão baseia-se em vários fatores, incluindo uma maior probabilidade de pequenas variações na semeadura ao trabalhar com bme2 e diferenças nas taxas de crescimento organoide individual em poços durante o período inicial de crescimento de 7 dias. Assim, devem ser semeadas, iguais ou mais de quatro réplicas técnicas por concentração de drogas.
Mais importante, a presença de células malignas que carregam a mutação do driver oncogênico e a contaminação limitada por células epiteliais normais das vias aéreas devem ser cuidadosamente avaliadas. Desafios no estabelecimento do NSCLC podem favorecer o crescimento das células epiteliais normais das vias aéreas7. Copiar perfis de números ou abordagens baseadas em PCR e sequenciamento para confirmar a presença das mutações oncogênicas do driver são os métodos escolhidos para garantir a qualidade das culturas organoides do NSCLC.
Modificações e solução de problemas do método
Os fatores de crescimento da mídia e dos respectivos fatores de crescimento adicionados às soluções básicas de mídia podem impactar significativamente a resposta de medicamentos a inibidores direcionados. Eles ativam receptores de bypass e vias de sinalização que influenciam e limitam a resposta a drogas (por exemplo, FGF, HGF, EGF)26. Embora uma mídia rica e personalizada de fator de crescimento possa ser ideal para a expansão da cultura organoide, a escalada de medicamentos e avaliações de sensibilidade devem ser realizadas em uma mídia de fator de crescimento reduzida, como descrito acima. Isso se baseia na experiência interna comparando diferentes formulações de mídia e dados de resposta a medicamentos (Figura 3C). Embora as soluções de mídia possam afetar o grau de sensibilidade a certos tratamentos medicamentosos e podem mudar os valores do IC50, fenótipos robustos de sensibilidade ou resistência são aparentes independentemente da formulação da mídia (Figura 3C,D). Além disso, recomenda-se a consistência geral na formulação de mídia e o perfil das respostas de medicamentos em culturas organoides, e uma quantidade igual ou superior a quatro réplicas técnicas por concentração precisa ser semeada. Isso é particularmente importante para faixas de benchmark em sensibilidade versus. resistência para o Inibidor de Interesse.
Limitações do método
O protocolo aqui apresentado descreve a sensibilidade dos modelos organoides de câncer NSCLC 3D aos inibidores direcionados quando as células cancerígenas derivadas do paciente são cultivadas. Experimentos adicionais, incluindo análise farmacodinâmica sobre a inibição da via e análise de sequenciamento para a presença do oncogene do motorista e mutações secundárias, são necessários para uma caracterização detalhada da resistência e sensibilidade medicamentosas. Além disso, fatores de espectadores como estímulos microambientais derivados de interações ou fatores secretados por células não cancerígenas no microambiente tumoral não são contabilizados, e novos protocolos são necessários quando modelos organoides de co-cultura com células imunes ou estromais são tentados. Trabalhos recentes têm destacado o uso de modelos organoides para recapitular interações de microambientes tumorais e respostas de perfil a inibidores de checkpoint imunológico, como o tratamento anti-PD-L1113,31.
A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
Modelos organoides de câncer 3D recapitulam a diversidade genética e os determinantes da resposta ao tratamento presentes no tumor original4,5,6. Notavelmente, a heterogeneidade espacial e temporal pode promover a evolução do tumor, e o surgimento paralelo e o desenvolvimento sequencial de subclonas tumorais podem ocorrer32,33. A heterogeneidade intratumor é significativa para a seleção de células tumorais mais resistentes sob pressão terapêutica9,34,35. O protocolo aqui fornecido permite uma rápida avaliação das sensibilidades ao tratamento com inibidores direcionados em amostras próximas ao paciente. Assim, os modelos organoides têm vantagens sobre modelos de linha celular homogênea mais convencionais sem diversidade genética ou estudos de longo prazo usando linhas celulares ou xenoenxertos derivados do paciente. Além disso, o presente protocolo permite escalar até múltiplos braços de tratamento e abordagens de tratamento combinacional com poucas limitações quanto ao custo e capacidade analítica. Como tal, adicionar uma segunda droga de interesse em uma dose fixa, enquanto escala o inibidor principalmente direcionado e comparando-o com a escalada do inibidor principalmente direcionado sozinho permite avaliar eficientemente os efeitos combinatórios potenciais e com a biomassa adicional mínima necessária (Figura Suplementar 3). Comparado com avaliações baseadas em imagens usadas para monitorar o desenvolvimento organoide e a resposta a medicamentos, o ensaio de sobrevivência celular baseado em luminescência descrito aqui tem sensibilidade semelhante com equipamento mínimo e treinamento necessário.
Importância e aplicações potenciais do método em áreas específicas de pesquisa
O desenvolvimento de um pipeline padronizado que permite estabelecer modelos organoides de câncer a partir de amostras de pacientes e as sensibilidades subsequentes das drogas têm um potencial de aplicabilidade clínica significativo. O perfil farmacológico ex vivo ganhou reconhecimento na detecção de vulnerabilidades e características associadas à resistência em tumores, correlacionando-se com a resposta ao tratamento em pacientes36,37. Significativamente, o perfil ex vivo de sensibilidades medicamentosas pode auxiliar na seleção do tratamento na clínica e no desenho de tratamentos combinacionais racionais que abordam mecanismos de resistência. No geral, essa abordagem poderia ajudar a permitir melhores estratégias personalizadas para terapia molecular ou regimes de tratamento combinatório. Este último pode ajudar a direcionar os mecanismos de tolerância e resistência de medicamentos precocemente e aprofundar a resposta clínica para melhorar os resultados dos pacientes no futuro.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos laboratórios de Jeroen P Roose (UCSF) e Calvin J Kuo (Stanford) por sua contribuição em relação à cultura organoide e desenvolvimento de protocolos. Agradecemos ainda a Oghenekevwe M. Gbenedio (laboratório Roose, UCSF) por protocolos e entrada de estabelecimento de amostras. Este projeto de pesquisa foi realizado com apoio do NIH [U54CA224081]. F. Haderk foi apoiado pela bolsa de pós-doutorado Mildred Scheel da Ajuda alemã ao Câncer.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |