이 프로토콜은 NSCLC 환자 유래 오가노이드 모델에서 표적화된 신호전달 억제제에 대한 약물 민감성의 표준화된 평가를 기술한다.
임상 환자 표본으로부터 유래된 신규한 3D 암 오가노이드 배양물은 암에서 표적 억제제에 대한 종양 내 이질성 및 치료 반응을 평가하는 중요한 모델 시스템을 나타낸다. 위장 및 췌장암의 선구적인 연구는 환자 근접 배양 시스템으로서의 환자 유래 오가노이드 (PDO)의 약속을 강조했으며 점점 더 많은 모델이 등장하고 있습니다. 마찬가지로, 다른 암 유형에서의 연구는 오가노이드 모델을 수립하고 배양 프로토콜을 최적화하는 데 중점을 두었습니다. 특히, 3D 암 오가노이드 모델은 원래의 종양 표본의 유전 적 복잡성을 유지하므로 종양 유래 시퀀싱 데이터를 실험 환경에서 유전적으로 정보에 입각 한 표적 치료법을 사용한 치료로 변환합니다. 또한, PDO는 미래에 종양의 내성 관련 적응을 극복하기 위해 합리적인 조합 치료의 평가를 촉진 할 수 있습니다. 후자는 내성 개발이 궁극적으로 표적 억제제의 치료 성공을 제한하기 때문에 비 소세포 폐암 (NSCLC)에 대한 강렬한 연구 노력에 중점을 둡니다. NSCLC PDO를 이용한 치료적 표적화 가능한 기작의 조기 평가는 합리적인 조합 치료를 알리는 데 도움이 될 수 있다. 이 원고는 NSCLC 유래 3D PDO의 표적 억제제에 대한 약물 민감성의 세포 배양 플레이트 기반 평가를위한 표준화 된 프로토콜을 설명하며, 병용 치료 및 기타 치료 양식에 대한 잠재적 인 적응성을 설명합니다.
발암 유발 운전자에 대한 맞춤형 치료법은 암 치료에 혁명을 일으켜 환자 생존을 개선하고 치료 매개 부작용을 줄였습니다1. 분자 진단 및 시퀀싱 기술의 최근 발전은 인간 종양의 복잡성을 강조했으며, 공간적 및 시간적 이질성이 치료 반응에 영향을 미쳤습니다2. 세포 배양 모델에서 이러한 아클론 차이를 되풀이하는 것은 오랫동안 달리 균일한 세포주에서 관심있는 선택된 변경을 조사하는 것으로 제한되어왔다. 종양 생검 또는 외과적 종양 절제술로부터 생성된 새로 개발된 3D PDO 모델은 환자 유래 종양 조직 내의 세포 복잡성 및 신호전달 누화의 개선된 표현을 가능하게 한다3. 이와 같이, 위장암 및 췌장암으로부터 유래된 종양 오가노이드는 성공적으로 생성되었고, 치료 반응의 유전적 다양성 및 결정인자를 재구성한다4,5,6. 비소세포 폐암(NSCLC)에서는 오가노이드 개발 및 확립 과제가 인정되며, 향후 NSCLC PDO를 보다 광범위하고 체계적으로 사용할 수 있도록 배양 기술 및 선택적 배지 인자의 최적화가 필요합니다7,8.
초기 약물 치료를 견디는 잔류 종양 세포를 표적으로 하는 조합 요법을 개발하는 것은 내성 발달을 억제하고 궁극적으로 환자 생존을 향상시키는 데 필수적입니다9. 오가노이드 배양의 구조적 복잡성을 감안할 때, 고전적인 약물 반응 파라미터는 약물 민감성에 대한 정확하고 재현 가능한 테스트를 허용하도록 최적화되어야합니다. 다른 기술들 중에서도 세포 ATP 풍부도6,12를 측정하는 영상-기반 판독값10,11 및 고전적 세포 생존력 분석이 PDO 배양물에서 약물 반응을 프로파일링하는데 이용가능하다. 여기에서, 우리는 NSCLC PDO 모델에서 알려진 임상 동인에 대한 표적 치료에 대한 약물 민감성을 평가하기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 설명합니다.
이 원고는 NSCLC 유래 3D PDO 모델에서 약물 민감도를 평가하기 위한 표준화된 프로토콜을 개발하고 설명합니다. 약물 민감성 연구 외에도 약물 민감도의 차이에 대한 근본적인 원인을 결정하기 위해 사용 가능한 오가노이드 모델의 추가 특성화가 필요합니다. 이는 오가노이드 및 환자 표본의 유전자 프로파일링 및 분화 마커 및 일반적인 세포 신호전달 바이오마커 및 생리학에 대한 면역조직화학 염색과 같은 오가노이드에 이용가능한 다른 분석을 포함할 수 있다13,29.
프로토콜의 중요한 단계
여기에 요약된 프로토콜은 신중하게 따를 때 정확하고 재현 가능한 약물 민감도 분석을 허용하는 표준화된 워크플로우를 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 생성 동안 트립LE 및 DNAse I 소화, BME2의 단일 세포 현탁액의 시딩, 치료까지 오가노이드 성장 모니터링, 배지 변화, 발광 기반 세포 생존 판독 동안 BME2 임베디드 오가노이드의 붕괴 및 용해 등 특별한 조치를 취해야 합니다. (1) TrypLE 기반 오가노이드의 해리 후 추가적인 DNAse I 소화가 정기적 인 배양 유지 보수 중에 오가노이드 모델을 확장하는 데 필수적이지는 않지만, 약물 에스컬레이션 실험을 위해 시딩 할 때 DNAse I 소화를 생략해서는 안되며, 오가노이드 클러스터를 단일 세포 현탁액으로 더 잘 분리하고 정확한 세포 계수를 보장하므로 생략해서는 안됩니다. (2) BME2 내의 단일 세포 현탁액의 시딩은 실온에서 BME2의 응고를 주어진 중요한 단계를 나타낸다. 따라서 최대 1-2 행을 한 번에 시드해야하며 추가 행이 시드되기 전에 샘플을 얼음 위에 놓아야합니다. 참고로, 세포는 균질한 세포 현탁액을 허용하기 위해 시딩이 계속될 때 위아래로 피펫팅될 필요가 있다. (3) 오가노이드 성장은 파종에서 치료까지 7 일간의 확장 동안주의 깊게 모니터링해야합니다. 예상되는 개발의 예는 그림 1B 및 보충 표 1에 나와 있습니다. 참고로, 도 1B 에 제시된 바와 같이 브라이트필드 현미경 및 이미지 분석에 의한 오가노이드 크기의 변화를 평가하는 것은 오가노이드 성장 및 배가시간의 차이에 대한 정밀한 평가를 가능하게 할 수 있다. 두 배가 되는 시간은 최근 문헌30에서 논의된 바와 같이 약물 반응에 영향을 미칠 수 있다. 오가노이드 성장 속도가 제시된 예를 유의하게 초과하는 경우, 치료 개시까지의 더 짧은 팽창 시간 및 더 짧은 치료 기간이 고려될 수 있다. (4) 또한 흡인 오가노이드를 피하기 위해 매체를 변경할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 6시 방향의 BME2 임베디드 오가노이드의 시딩 위치는 플레이트가 시계 방향으로 180 ° 회전하고 미디어가 오가노이드의 반대 위치에서 흡인 될 때 미디어의 안전한 흡인을 가능하게합니다. (5) 마지막으로, 생존 판독 동안 BME2 임베디드 오가노이드의 철저한 용해는 정확한 결과를 기록하는 데 필수적입니다. 제조업체의 지침에 따르면, 샘플은 적절한 용해를 보장하기 위해 여과되지 않은 팁을 사용하여 이상적으로 위아래로 반복적으로 피펫팅되어야합니다. 인큐베이션 시간은 설명된 바와 같이 뒤따라야 한다. 또한, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 최종 판독을 위해 용해물의 75%(전체 부피 대신)를 백색의 불투명 바닥 96웰 플레이트로 이송하면 각 웰에서 동일한 부피와 격렬한 피펫팅에 의해 도입될 수 있는 기포의 부재를 보장하므로 적절한 평가가 가능합니다.
참고로, BME2 포매된 오가노이드 배양물에서 약물 반응의 프로파일링은 정규 세포주 배양물에서 관찰된 것보다 더 높은 표준 편차를 나타낼 수 있다(도 2, 도 3A). 더 높은 표준 편차는 BME2로 작업 할 때 파종에 약간의 변동이 발생할 가능성이 증가하고 초기 7 일 성장 기간 동안 우물에서 개별 오가노이드 성장률의 차이를 포함하여 몇 가지 요인을 기반으로합니다. 따라서, 약물 농도 당 네 개 이상의 기술적 반복실험이 시딩되어야 한다.
가장 중요한 것은, 종양원성 동인 돌연변이를 운반하는 악성 세포의 존재와 정상 기도 상피 세포에 의한 제한된 오염이 신중하게 평가되어야 한다는 것이다. NSCLC 확립의 도전은 정상기도 상피 세포의 성장을 선호 할 수 있습니다7. 카피 수 프로파일링 또는 PCR- 및 시퀀싱-기반 접근법은 종양원성 구동기 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 NSCLC 오가노이드 배양의 품질을 보장하기 위해 선택되는 방법이다.
방법의 수정 및 문제 해결
기본 배지 솔루션에 첨가된 배지 및 각각의 성장 인자는 표적 억제제에 대한 약물 반응에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 그들은 약물 반응에 영향을 미치고 제한하는 우회 수용체 및 신호 전달 경로를 활성화시킵니다 (예 : FGF, HGF, EGF)26. 성장 인자가 풍부하고 맞춤화 된 배지가 오가노이드 배양을 확장하는 데 최적 일 수 있지만, 약물 에스컬레이션 및 민감도 평가는 위에서 설명한 바와 같이 감소 된 성장 인자 배지에서 수행되어야합니다. 이는 다양한 배지 제형과 약물 반응 데이터를 비교한 내부 경험을 기반으로 합니다(그림 3C). 배지 용액은 특정 약물 치료에 대한 민감도에 영향을 미칠 수 있고 IC50 값을 바꿀 수 있지만, 민감도 또는 저항의 견고한 표현형은 배지 제형에 관계없이 명백합니다 (그림 3C, D). 또한, 오가노이드 배양에 걸친 배지 제형 및 프로파일링 약물 반응의 일반적인 일관성이 권장되며, 농도당 동등하거나 네 개 이상의 기술적 반복실험이 시딩되어야 한다. 이는 민감도 대 민감도의 범위를 벤치마킹하는 데 특히 중요합니다. 관심의 억제제에 대한 내성.
방법의 제한 사항
여기에 제시된 프로토콜은 환자 유래 암 세포가 배양될 때 표적 억제제에 대한 NSCLC 3D 암 오가노이드 모델의 민감도를 기술한다. 동인 종양유전자 및 이차 돌연변이의 존재에 대한 경로 억제 및 시퀀싱 분석에 관한 약력학적 분석을 포함하는 추가적인 실험은 약물 내성 및 민감성의 상세한 특성화를 위해 필요하다. 또한, 종양 미세환경에서 비암 방관자 세포에 의한 상호작용 또는 분비된 인자로부터 유래된 미세환경 자극과 같은 방관자 인자는 설명되지 않으며, 면역 또는 기질 세포와 오가노이드 모델을 공동 배양할 때 새로운 프로토콜이 필요하다. 최근의 연구는 종양 미세환경 상호작용 및 항-PD-L1 치료와 같은 면역 체크포인트 억제제에 대한 프로파일 반응을 재검토하기 위한 오가노이드 모델의 사용을 강조하였다13,31.
기존 / 대체 방법에 대한 방법의 중요성
3D 암 오가노이드 모델은 원래의 종양에 존재하는 치료 반응의 유전적 다양성 및 결정인자를 재분석한다4,5,6. 특히, 공간적 및 시간적 이질성은 종양 진화를 촉진할 수 있고, 종양 서브클론의 병행 출현 및 순차적 발달이 발생할 수 있다32,33. 종양내 이질성은 치료적 압력 하에서보다 탄력적인 종양 세포의 선택에 중요하다9,34,35. 여기에 제공된 프로토콜은 환자-근접 샘플에서 표적 억제제를 사용한 치료에 대한 민감성의 신속한 평가를 가능하게 한다. 따라서, 오가노이드 모델은 유전적 다양성이 결여된 보다 통상적인 동질적인 세포주 모델 또는 세포주 또는 환자 유래 이종이식편을 이용한 장기 연구에 비해 이점을 갖는다. 또한, 본 프로토콜은 비용 및 분석 용량에 관한 몇 가지 제한과 함께 치료 및 조합 치료 접근법의 다중 팔까지 확장할 수 있게 한다. 이와 같이, 주로 표적화된 억제제를 에스컬레이션하면서 고정된 용량으로 관심있는 두 번째 약물을 첨가하고, 이를 주로 표적화된 억제제 단독의 에스컬레이션과 비교함으로써 잠재적인 조합 효과를 효율적으로 평가하고 필요한 최소한의 추가 바이오매스를 가능하게 한다(보충 그림 3). 오가노이드 발달 및 약물 반응을 모니터링하는 데 사용되는 이미징 기반 평가와 비교할 때, 여기에 설명된 발광 기반 세포 생존 분석은 최소한의 장비 및 훈련이 필요한 유사한 감도를 갖는다.
특정 연구 분야에서이 방법의 중요성과 잠재적 인 적용
환자 표본에서 암 오가노이드 모델을 확립하고 후속 약물 민감성 프로파일링을 가능하게 하는 표준화된 파이프라인을 개발하면 상당한 임상 적용 가능성을 보유할 수 있습니다. 생체외 약리학적 프로파일링은 종양의 취약성 및 내성-관련 특징을 검출하는 데서 인정을 받았으며, 환자의 치료 반응과 상관관계가 있다36,37. 유의하게도, 약물 민감성의 생체외 프로파일링은 클리닉에서의 치료 선택과 내성 메카니즘을 다루는 합리적 조합 치료의 설계에 도움이 될 수 있다. 전반적으로,이 접근법은 분자 치료 또는 조합 치료 요법을위한 개선 된 개인화 된 전략을 가능하게하는 데 도움이 될 수 있습니다. 후자는 약물 내성 및 내성 메커니즘을 조기에 표적화하고 향후 환자 결과를 개선하기 위해 임상 반응을 심화시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 Jeroen P Roose (UCSF)와 Calvin J Kuo (Stanford)의 실험실에서 오가노이드 문화 및 프로토콜 개발에 관한 의견을 보내 주셔서 감사합니다. 또한 프로토콜 및 샘플 설정 입력에 대해 Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF)에게 감사드립니다. 이 연구 프로젝트는 NIH [U54CA224081]의 지원으로 수행되었습니다. F. Hadrk은 독일 암 원조의 Mildred Scheel 박사후 펠로우십의 지원을 받았다.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |