Ce protocole décrit une évaluation standardisée des sensibilités médicamenteuses aux inhibiteurs de signalisation ciblés dans des modèles organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC.
De nouvelles cultures organoïdes cancéreuses 3D dérivées d’échantillons cliniques de patients représentent un système modèle important pour évaluer l’hétérogénéité intratumorale et la réponse au traitement aux inhibiteurs ciblés dans le cancer. Les travaux pionniers dans les cancers gastro-intestinaux et pancréatiques ont mis en évidence la promesse des organoïdes dérivés du patient (PDO) en tant que système de culture proche du patient, avec un nombre croissant de modèles émergents. De même, les travaux dans d’autres types de cancer se sont concentrés sur l’établissement de modèles organoïdes et l’optimisation des protocoles de culture. Notamment, les modèles organoïdes 3D du cancer maintiennent la complexité génétique des échantillons tumoraux originaux et traduisent ainsi les données de séquençage dérivées de la tumeur en traitement avec des thérapies ciblées génétiquement informées dans un cadre expérimental. En outre, les PDO pourraient favoriser l’évaluation de traitements combinés rationnels pour surmonter l’adaptation des tumeurs associée à la résistance à l’avenir. Ce dernier se concentre sur des efforts de recherche intenses dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), car le développement de la résistance limite finalement le succès du traitement des inhibiteurs ciblés. Une évaluation précoce des mécanismes thérapeutiquement ciblables à l’aide de PDO CPNPC pourrait aider à éclairer des traitements combinés rationnels. Ce manuscrit décrit un protocole normalisé pour l’évaluation sur plaque de culture cellulaire des sensibilités médicamenteuses aux inhibiteurs ciblés dans les AOP 3D dérivées du CPNPC, avec une adaptabilité potentielle aux traitements combinés et à d’autres modalités de traitement.
Les thérapies personnalisées contre les facteurs oncogènes ont révolutionné le traitement du cancer, améliorant la survie des patients et réduisant les effets secondaires médiés par le traitement1. Les progrès récents dans les technologies de diagnostic moléculaire et de séquençage ont mis en évidence la complexité des tumeurs humaines, l’hétérogénéité spatiale et temporelle ayant un impact sur la réponse au traitement2. La récapitulation de ces différences sous-clonales dans les modèles de culture cellulaire s’est longtemps limitée à l’étude de certaines altérations d’intérêt dans des lignées cellulaires par ailleurs uniformes. Les modèles d’AOP 3D nouvellement développés générés à partir de biopsies tumorales ou de résections chirurgicales de tumeurs permettent une meilleure représentation de la complexité cellulaire et de la diaphonie de signalisation dans le tissu tumoral dérivé du patient3. En tant que tels, des organoïdes tumoraux dérivés du cancer gastro-intestinal et du pancréas ont été générés avec succès et récapitulent la diversité génétique et les déterminants de la réponse au traitement4,5,6. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC), les défis liés au développement et à l’établissement d’organoïdes sont reconnus, et l’optimisation des techniques de culture et des facteurs de milieux sélectifs est nécessaire pour permettre une utilisation plus large et plus systématique des AOP du CPNPC à l’avenir7,8.
Le développement de thérapies combinatoires ciblant les cellules tumorales résiduelles qui résistent au traitement médicamenteux initial est essentiel pour inhiber le développement de la résistance et, en fin de compte, améliorer la survie des patients9. Compte tenu de la complexité architecturale des cultures organoïdes, les paramètres classiques de réponse aux médicaments doivent être optimisés pour permettre des tests précis et reproductibles des sensibilités aux médicaments. Des lectures basées sur l’imagerie10,11 et des tests classiques de viabilité cellulaire mesurant l’abondance cellulaire de l’ATP6,12, entre autres techniques, sont disponibles pour profiler les réponses aux médicaments dans les cultures aOP. Ici, nous développons et décrivons un protocole standardisé pour évaluer les sensibilités médicamenteuses au traitement ciblé par rapport aux facteurs cliniques connus dans les modèles d’AOP du CPNPC.
Ce manuscrit développe et décrit un protocole normalisé pour évaluer la sensibilité aux médicaments dans les modèles d’AOP 3D dérivés du CPNPC. En plus des études de sensibilité aux médicaments, une caractérisation plus approfondie des modèles organoïdes disponibles est nécessaire pour déterminer les causes sous-jacentes des différences de sensibilité aux médicaments. Cela peut inclure le profilage génétique des organoïdes et des échantillons de patients et d’autres analyses disponibles pour les organoïdes, telles que la coloration immunohistochimique pour les marqueurs de différenciation et les biomarqueurs et la physiologie de la signalisation cellulaire générale13,29.
Étapes critiques du protocole
Le protocole décrit ici fournit un flux de travail normalisé qui permet des analyses précises et reproductibles de la sensibilité aux médicaments lorsqu’elles sont suivies attentivement. Des précautions particulières doivent être prises dans les étapes suivantes: digestion trypLE et DNAse I pendant la génération de suspensions unicellulaires, ensemencement de suspensions unicellulaires dans BME2, surveillance de la croissance organoïde jusqu’au traitement, changements de milieu et perturbation et lyse des organoïdes incorporés BME2 pendant la lecture de la survie cellulaire basée sur la luminescence. (1) Bien qu’une digestion supplémentaire du DNAse I après dissociation des organoïdes à base de TrypLE ne soit pas essentielle pour l’expansion des modèles organoïdes lors de la maintenance régulière de la culture, la digestion DNAse I ne doit pas être omise lors de l’ensemencement pour les expériences d’escalade de médicaments, car elle assure une meilleure séparation des amas organoïdes en suspensions unicellulaires et un comptage précis des cellules. (2) L’ensemencement d’une suspension monocellulaire dans BME2 représente une étape critique compte tenu de la solidification de BME2 à température ambiante. Ainsi, un maximum de 1 à 2 rangées doit être ensemencé à la fois, et les échantillons doivent être placés sur la glace avant que des rangées supplémentaires ne soient ensemencées. Il convient de noter que les cellules doivent être pipetées de haut en bas lorsque l’ensemencement se poursuit pour permettre une suspension cellulaire homogène. (3) La croissance des organoïdes doit être surveillée attentivement pendant l’expansion de 7 jours, de l’ensemencement au traitement. Un exemple de l’évolution attendue est donné à la figure 1B et au tableau supplémentaire 1. Il convient de noter que l’évaluation des changements de taille des organoïdes par microscopie en champ clair et analyse d’images, comme présenté à la figure 1B , peut permettre une évaluation précise des différences de croissance des organoïdes et de temps de doublement. Les temps de doublement peuvent avoir un impact sur les réponses aux médicaments, comme on l’a récemment vu dans la littérature30. Si le taux de croissance organoïde dépasse de manière significative l’exemple présenté, un temps d’expansion plus court jusqu’au début du traitement et une durée de traitement plus courte peuvent être envisagés. (4) En outre, des précautions particulières doivent être prises lors du changement de support pour éviter d’aspirer les organoïdes. La position d’ensemencement des organoïdes incorporés BME2 à la position de 6 heures permet une aspiration sûre du support lorsque les plaques sont tournées dans le sens des aiguilles d’une montre de 180 ° et que le support est aspiré à la position opposée des organoïdes. (5) Enfin, une lyse approfondie des organoïdes incorporés dans la BME2 pendant la lecture de survie est essentielle pour enregistrer des résultats précis. Selon les instructions du fabricant, les échantillons doivent être pipetés de haut en bas à plusieurs reprises, idéalement à l’aide d’embouts non filtrés, pour assurer une lyse appropriée. Les temps d’incubation doivent être suivis comme décrit. De plus, le transfert de 75 % du lysat (au lieu du volume total) sur une plaque blanche opaque de 96 puits pour la lecture finale à l’aide d’un lecteur de plaque ELISA permet une évaluation appropriée, car cela garantit le même volume dans chaque puits et l’absence de bulles d’air qui peuvent être introduites par un pipetage vigoureux.
Il convient de noter que le profilage des réponses aux médicaments dans les cultures organoïdes incorporées dans la BME2 peut montrer un écart-type plus élevé que celui observé dans les cultures régulières de lignées cellulaires (figure 2, figure 3A). L’écart-type plus élevé est basé sur plusieurs facteurs, y compris une probabilité accrue de variations mineures dans l’ensemencement lors du travail avec BME2 et des différences dans les taux de croissance organoïdes individuels entre les puits au cours de la période de croissance initiale de 7 jours. Ainsi, des répétitions techniques égales ou supérieures à quatre répétitions techniques par concentration de médicament doivent être ensemencées.
Plus important encore, la présence de cellules malignes porteuses de la mutation du conducteur oncogène et la contamination limitée par les cellules épithéliales normales des voies respiratoires doivent être soigneusement évaluées. Les défis dans l’établissement du CPNPC peuvent favoriser l’excroissance des cellules épithéliales normales des voies respiratoires7. Le profilage des numéros de copie ou les approches basées sur la PCR et le séquençage pour confirmer la présence des mutations du pilote oncogène sont les méthodes de choix pour assurer la qualité des cultures organoïdes du CPNPC.
Modifications et dépannage de la méthode
Les milieux et les facteurs de croissance respectifs ajoutés aux solutions de milieux de base peuvent avoir un impact significatif sur la réponse des médicaments aux inhibiteurs ciblés. Ils activent les récepteurs de dérivation et les voies de signalisation qui influencent et limitent la réponse aux médicaments (par exemple, FGF, HGF, EGF)26. Bien qu’un milieu riche en facteur de croissance et adapté puisse être optimal pour l’expansion de la culture organoïde, les évaluations de l’escalade et de la sensibilité des médicaments doivent être effectuées dans un milieu à facteur de croissance réduit, comme indiqué ci-dessus. Ceci est basé sur l’expérience interne de comparaison de différentes formulations de milieux et de données sur la réponse aux médicaments (Figure 3C). Alors que les solutions de milieux peuvent affecter le degré de sensibilité à certains traitements médicamenteux et peuvent modifier les valeurs de la CI50, des phénotypes robustes de sensibilité ou de résistance sont apparents quelle que soit la formulation du milieu (Figure 3C,D). En outre, la cohérence générale dans la formulation du milieu et le profilage des réponses médicamenteuses entre les cultures organoïdes sont recommandés, et un nombre égal ou supérieur à quatre répétitions techniques par concentration doit être ensemencé. Ceci est particulièrement important pour comparer les plages de sensibilité par rapport à. résistance à l’inhibiteur d’intérêt.
Limites de la méthode
Le protocole présenté ici décrit la sensibilité des modèles organoïdes cancéreux 3D du CPNPC aux inhibiteurs ciblés lorsque des cellules cancéreuses dérivées de patients sont cultivées. Des expériences supplémentaires, y compris l’analyse pharmacodynamique concernant l’inhibition des voies et l’analyse du séquençage de la présence de l’oncogène conducteur et des mutations secondaires, sont nécessaires pour une caractérisation détaillée de la résistance aux médicaments et de la sensibilité. En outre, les facteurs de spectateur tels que les stimuli microenvironnementaux dérivés d’interactions ou les facteurs sécrétés par des cellules non cancéreuses dans le microenvironnement tumoral ne sont pas pris en compte, et de nouveaux protocoles sont nécessaires lorsque des modèles organoïdes de co-culture avec des cellules immunitaires ou stromales sont tentés. Des travaux récents ont mis en évidence l’utilisation de modèles organoïdes pour récapituler les interactions du microenvironnement tumoral et profiler les réponses aux inhibiteurs du point de contrôle immunitaire, tels que le traitement anti-PD-L113,31.
L’importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes / alternatives
Les modèles organoïdes cancéreux 3D récapitulent la diversité génétique et les déterminants de la réponse au traitement présents dans la tumeur d’origine4,5,6. Notamment, l’hétérogénéité spatiale et temporelle peut favoriser l’évolution tumorale, et l’émergence parallèle et le développement séquentiel de sous-clones tumoraux peuvent se produire32,33. L’hétérogénéité intratumorale est significative pour la sélection de cellules tumorales plus résilientes sous pression thérapeutique9,34,35. Le protocole fourni ici permet une évaluation rapide des sensibilités au traitement par inhibiteurs ciblés dans des échantillons proches du patient. Ainsi, les modèles organoïdes présentent des avantages par rapport aux modèles de lignées cellulaires homogènes plus conventionnels dépourvus de diversité génétique ou d’études à long terme utilisant des lignées cellulaires ou des xénogreffes dérivées de patients. De plus, le protocole actuel permet de passer à plusieurs branches de traitement et d’approches de traitement combinées avec peu de limitations en termes de coût et de capacité d’analyse. En tant que tel, l’ajout d’un deuxième médicament d’intérêt à une dose fixe tout en augmentant l’inhibiteur principalement ciblé et en le comparant à l’escalade de l’inhibiteur principalement ciblé seul permet d’évaluer efficacement les effets combinatoires potentiels et avec un minimum de biomasse supplémentaire requise (figure supplémentaire 3). Comparé aux évaluations basées sur l’imagerie utilisées pour surveiller le développement des organoïdes et la réponse aux médicaments, le test de survie cellulaire basé sur la luminescence décrit ici présente une sensibilité similaire avec un minimum d’équipement et de formation requis.
Importance et applications potentielles de la méthode dans des domaines de recherche spécifiques
Le développement d’un pipeline standardisé qui permet d’établir des modèles organoïdes cancéreux à partir d’échantillons de patients et le profilage ultérieur des sensibilités médicamenteuses présente un potentiel d’applicabilité clinique important. Le profilage pharmacologique ex vivo a été reconnu dans la détection des vulnérabilités et des caractéristiques associées à la résistance dans les tumeurs, en corrélation avec la réponse au traitement chez les patients36,37. De manière significative, le profilage ex vivo des sensibilités aux médicaments peut aider à la sélection du traitement en clinique et à la conception de traitements combinatoires rationnels traitant des mécanismes de résistance. Dans l’ensemble, cette approche pourrait aider à améliorer les stratégies personnalisées pour la thérapie moléculaire ou les schémas thérapeutiques combinatoires. Ce dernier peut aider à cibler les mécanismes de tolérance et de résistance aux médicaments à un stade précoce et à approfondir la réponse clinique afin d’améliorer les résultats pour les patients à l’avenir.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les laboratoires de Jeroen P Roose (UCSF) et Calvin J Kuo (Stanford) pour leur contribution concernant la culture organoïde et le développement de protocoles. Nous remercions également Oghenekevwe M. Gbenedio (Laboratoire Roose, UCSF) pour les protocoles et la saisie d’échantillons dans l’établissement. Ce projet de recherche a été mené avec le soutien du NIH [U54CA224081]. F. Haderk a été soutenu par la bourse postdoctorale Mildred Scheel de l’Aide allemande contre le cancer.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |