このプロトコールは、NSCLC患者由来オルガノイドモデルにおける標的シグナル伝達阻害剤に対する薬物感受性の標準化された評価を記載している。
臨床患者検体に由来する新規な3Dがんオルガノイド培養物は、がんにおける標的阻害剤に対する腫瘍内の不均一性および治療応答を評価するための重要なモデル系を表す。胃腸がんおよび膵臓がんにおける先駆的な研究は、患者近接培養システムとしての患者由来オルガノイド(PDO)の有望さを強調しており、モデルの数が増えています。同様に、他のがんタイプにおける研究は、オルガノイドモデルの確立と培養プロトコルの最適化に焦点を当てている。特に、3Dがんオルガノイドモデルは、元の腫瘍標本の遺伝的複雑さを維持し、腫瘍由来のシーケンシングデータを実験環境での遺伝的に情報に基づいた標的療法による治療に変換します。さらに、PDOは、将来的に腫瘍の耐性関連適応を克服するための合理的な併用治療の評価を促進する可能性がある。後者は、耐性の発達が最終的に標的阻害剤の治療成功を制限するため、非小細胞肺癌(NSCLC)における集中的な研究努力に焦点を当てている。NSCLC PDOを用いた治療的に標的化可能なメカニズムの早期評価は、合理的な併用治療の情報提供に役立つ可能性がある。この原稿は、NSCLC由来の3D PDOにおける標的阻害剤に対する薬物感受性の細胞培養プレートベースの評価のための標準化されたプロトコルを記載しており、併用治療および他の治療様式への潜在的な適応性を有する。
発癌性ドライバーに対する個別化療法は、がん治療に革命をもたらし、患者の生存率を向上させ、治療を媒介する副作用を軽減しました1。分子診断およびシーケンシング技術における最近の進歩は、ヒト腫瘍の複雑さを浮き彫りにし、空間的および時間的不均一性が治療応答に影響を与えている2。細胞培養モデルにおけるこれらのサブクローナルの違いを繰り返すことは、長い間、そうでなければ均一な細胞株における関心のある選択された変化を調査することに限られてきた。腫瘍生検または外科的腫瘍切除から生成された新しく開発された3D PDOモデルにより、患者由来の腫瘍組織における細胞の複雑さとシグナル伝達クロストークの表現が改善されます3。このように、胃腸がんおよび膵臓がんに由来する腫瘍オルガノイドが首尾よく生成され、治療応答の遺伝的多様性および決定要因を再現している4,5,6。非小細胞肺がん(NSCLC)では、オルガノイドの開発と樹立の課題が認識されており、将来的にNSCLC PDOをより広範かつ体系的に使用できるようにするためには、培養技術と選択的培地因子の最適化が必要です7,8。
初期の薬物治療に耐える残存腫瘍細胞を標的とする組み合わせ療法の開発は、耐性の発達を阻害し、最終的には患者の生存率を改善するために不可欠です9。オルガノイド培養のアーキテクチャの複雑さを考えると、古典的な薬物応答パラメータを最適化して、薬物感受性の正確で再現性のある試験を可能にする必要があります。イメージングベースの読み出し10,11および細胞ATP存在量を測定する古典的な細胞生存率アッセイ6,12は、とりわけ、PDO培養における薬物応答をプロファイルするために利用可能である。ここでは、NSCLC PDOモデルにおける既知の臨床ドライバーに対する標的療法に対する薬物感受性を評価するための標準化されたプロトコルを開発し、記述する。
この原稿は、NSCLC由来の3D PDOモデルにおける薬物感受性を評価するための標準化されたプロトコルを開発し、記述する。薬物感受性試験に加えて、薬物感受性の違いの根底にある原因を特定するために、利用可能なオルガノイドモデルのさらなる特性評価が必要である。これには、オルガノイドおよび患者検体の遺伝子プロファイリング、ならびにオルガノイドに利用可能な他の分析、例えば、分化マーカーおよび一般的な細胞シグナル伝達バイオマーカーおよび生理学のための免疫組織化学染色などが含まれ得る13,29。
プロトコルの重要なステップ
本明細書に概説するプロトコールは、注意深く従えば正確で再現性のある薬物感受性分析を可能にする標準化されたワークフローを提供する。単一細胞懸濁液の生成中のTrypLEおよびDNAse I消化、BME2における単一細胞懸濁液の播種、治療までのオルガノイド増殖のモニタリング、培地変化、および発光ベースの細胞生存率読み出し中のBME2包埋オルガノイドの破壊および溶解。(1)オルガノイドのTrypLEベースの解離後の追加のDNAse I消化は、定期的な培養メンテナンス中にオルガノイドモデルを拡大するために必須ではないが、DNAse I消化は、オルガノイドクラスターの単一細胞懸濁液へのより良い分離および正確な細胞計数を保証するので、薬物エスカレーション実験のために播種する際に省略すべきではない。(2)BME2における単一細胞懸濁液の播種は、室温でのBME2の固化を考えると重要な工程を表す。したがって、一度に最大 1 ~ 2 行を播種する必要があり、追加の行を播種する前にサンプルを氷の上に置く必要があります。注目すべきは、均質な細胞懸濁液を可能にするために、播種を継続する際に細胞を上下にピペットで固定する必要があることである。(3)オルガノイドの増殖は、播種から施術までの7日間、注意深く観察する必要がある。予想される開発の例を 図 1B および 補足表 1 に示します。注目すべきは、 図1B に示されているように、明視野顕微鏡および画像解析によってオルガノイドサイズの変化を評価することによって、オルガノイドの成長および倍加時間の違いの正確な評価を可能にする可能性がある。倍増時間は、最近文献で議論されているように、薬物反応に影響を与える可能性があります30。オルガノイド増殖速度が提示された例を有意に超える場合、治療開始までのより短い拡張時間およびより短い治療期間が考慮され得る。(4)また、培地を交換する際には、オルガノイドを吸引しないように特別な注意を払わなければなりません。BME2埋め込みオルガノイドの播種位置は6時位置で、プレートを時計回りに180°回転させ、オルガノイドの反対位置で培地を吸引すると、メディアの安全な吸引を可能にします。(5)最後に、生存中のBME2埋め込みオルガノイドの徹底的な溶解は、正確な結果を記録するために不可欠である。メーカーの指示に従って、サンプルは、適切な溶解を確実にするために、理想的には濾過されていない先端を使用して、繰り返し上下にピペットで固定する必要があります。インキュベーション時間は、記載されているように従う必要があります。さらに、ELISAプレートリーダーを使用した最終読み出しのために溶解液の75%を(総容量の代わりに)白色の不透明な底部96ウェルプレートに移すことで、各ウェルに同じ体積が保証され、激しいピペッティングによって導入できる気泡がないことが保証されるため、適切な評価が可能になります。
注目すべきは、BME2包埋オルガノイド培養における薬物応答のプロファイリングは、通常の細胞株培養で観察されるよりも高い標準偏差を示す可能性がある(図2、 図3A)。より高い標準偏差は、BME2を扱う際の播種におけるわずかな変動の可能性の増加、および最初の7日間の成長期間にわたるウェル間の個々のオルガノイド増殖速度の違いを含むいくつかの要因に基づいている。したがって、薬物濃度あたり4つ以上の技術的反復が播種されるべきである。
最も重要なのは、発癌性ドライバー変異および正常な気道上皮細胞による限定的な汚染を有する悪性細胞の存在を注意深く評価しなければならないことである。NSCLC樹立における課題は、正常な気道上皮細胞の伸長に有利に働く可能性があります7。発癌性ドライバー変異の存在を確認するためのコピー数プロファイリングまたはPCRおよびシーケンシングベースのアプローチは、NSCLCオルガノイド培養物の品質を保証するために選択される方法である。
メソッドの変更とトラブルシューティング
基本培地溶液に添加された培地およびそれぞれの成長因子は、標的阻害剤に対する薬物応答に有意に影響を及ぼす可能性がある。それらは、薬物応答に影響を与え制限するバイパス受容体およびシグナル伝達経路(例えば、FGF、HGF、EGF)を活性化する26。成長因子が豊富でカスタマイズされた培地はオルガノイド培養の拡大に最適かもしれないが、薬物のエスカレーションおよび感受性評価は、上で概説したように、減少した成長因子培地で実施されるべきである。これは、異なる媒体製剤と薬物応答データを比較した内部経験に基づいています(図3C)。培地溶液は、特定の薬物処理に対する感受性の程度に影響を与え、IC50 値をシフトさせる可能性がありますが、培地の配合に関係なく、感度または耐性の堅牢な表現型は明らかです(図3C、D)。さらに、培地製剤における一般的な一貫性と、オルガノイド培養物全体にわたる薬物応答のプロファイリングが推奨され、濃度あたり4つ以上の技術的反復を播種する必要があります。これは、感度 対感度の範囲をベンチマークするために特に重要です。対象の阻害剤に対する耐性。
方法の制限事項
ここで提示されたプロトコールは、患者由来の癌細胞が培養されるときの標的阻害剤に対するNSCLC 3D癌オルガノイドモデルの感受性を記載する。経路阻害に関する薬力学的分析、およびドライバー癌遺伝子および二次変異の存在に関するシーケンシング分析を含む追加の実験は、薬剤耐性および感受性の詳細な特性評価のために必要である。また、腫瘍微小環境における非癌傍観細胞による相互作用や分泌因子に由来する微小環境刺激などの傍観因子は考慮されておらず、免疫細胞や間質細胞との共培養オルガノイドモデルを試みる際には新規なプロトコールが必要である。最近の研究は、腫瘍微小環境相互作用を再現し、抗PD-L1治療などの免疫チェックポイント阻害剤に対する応答をプロファイルするためのオルガノイドモデルの使用を強調しています13,31。
既存/代替方法に対する本方法の重要性
3Dがんオルガノイドモデルは、元の腫瘍に存在する治療応答の遺伝的多様性と決定要因を再現しています4,5,6。特に、空間的および時間的不均一性は腫瘍の進化を促進し、腫瘍サブクローンの出現と逐次的発生が並行して起こり得る32,33。腫瘍内の不均一性は、治療圧力下でのより弾力性のある腫瘍細胞の選択にとって有意である9、34、35。ここで提供されるプロトコルは、患者と近接するサンプル中の標的阻害剤による治療に対する感受性の迅速な評価を可能にする。したがって、オルガノイドモデルは、遺伝的多様性を欠くより従来の均質な細胞株モデル、または細胞株または患者由来異種移植片を用いた長期研究よりも利点を有する。さらに、現在のプロトコルは、コストおよび分析能力に関する制限をほとんど伴わずに、複数の治療アームおよび組み合わせ治療アプローチにスケールアップすることを可能にする。そのため、主標的阻害剤をエスカレーションしながら、目的の第2の薬剤を一定用量で添加し、それを主標的阻害剤単独のエスカレーションと比較することで、必要な追加バイオマスを最小限に抑えながら、潜在的な組み合わせ効果を効率的に評価することができます(補足図3)。オルガノイドの発生および薬物応答をモニターするために使用されるイメージングベースの評価と比較して、ここで説明する発光ベースの細胞生存アッセイは、最小限の装置およびトレーニングで同様の感度を有する。
特定の研究分野におけるこの方法の重要性と潜在的な応用
患者検体からがんオルガノイドモデルを確立し、その後の薬剤感受性プロファイリングを可能にする標準化されたパイプラインを開発することは、臨床応用可能性の高い可能性を秘めています。エクスビボ薬理学的プロファイリングは、腫瘍の脆弱性および耐性関連特徴を検出する際に認識されており、患者の治療応答と相関している36,37。重要なことに、薬物感受性のエクスビボプロファイリングは、診療所における治療選択および耐性メカニズムに対処する合理的な併用治療の設計に役立つ可能性がある。全体として、このアプローチは、分子療法または組み合わせ治療レジメンのための改善されたパーソナライズされた戦略を可能にするのに役立つ可能性がある。後者は、薬物耐性および耐性メカニズムを早期に標的化し、臨床反応を深めて将来の患者の転帰を改善するのに役立つ可能性がある。
The authors have nothing to disclose.
我々は、オルガノイド培養及びプロトコル開発に関する彼らの意見について、Jeroen P Roose(UCSF)及びCalvin J Kuo(スタンフォード)の研究室に感謝する。我々はさらに、Oghenekevwe M. Gbenedio(Roose lab, UCSF)のプロトコル及びサンプル確立のインプットに感謝する。本研究プロジェクトは、NIH [U54CA224081]の支援を受けて実施されました。F. Haderkは、German Cancer AidのMildred Scheelポスドクフェローシップの支援を受けました。
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |