Burada sunulan prostat epitel organoidleri farmakolojik yanıtları çalışma için bir protokoldür. Organoidler vivo biyolojiye çok benzer ler ve hasta genetiğini yeniden özetlerler, bu da onları çekici model sistemleri haline getirir. Prostat organoidleri wildtype prostatlar, genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir.
Burada sunulan bir protokol farmakodinamik çalışma, kök hücre potansiyeli, ve prostat epitel organoidlerde kanser farklılaşması. Prostat organoidleri, prostatik epiteli andıran tanımlanmış bir ortamda yetişen androjen duyarlı, üç boyutlu (3D) kültürlerdir. Prostat organoidleri vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir. Daha da önemlisi, hasta kaynaklı organoidler genetik ve in vivo tümör biyolojisindeki tümörlere çok benzerler. Ayrıca, organoidler CRISPR/Cas9 ve shRNA sistemleri kullanılarak genetik olarak manipüle edilebilir. Bu kontrollü genetik, genotiplerin ve mutasyonprofillerinin farmakolojik yanıtlar üzerindeki etkilerini hızla test etmek için bir platform olarak organoid kültürü cazip kılmaktadır. Ancak, deneysel protokoller özellikle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için organoid kültürlerin 3D doğaya adapte edilmelidir. Burada tanımlanan organoid oluşum kapasitesini belirlemek için tohumlama tahlilleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller vardır. Daha sonra, bu rapor ilaç tedavilerini nasıl gerçekleştireceklerini ve canlılık ölçümleri, protein izolasyonu ve RNA izolasyonu yoluyla farmakolojik yanıtın nasıl analiz edilebildiğini göstermektedir. Son olarak, protokol, organoidlerin ksenogreftleme için nasıl hazırlanacağını ve subkutan greftleme kullanılarak in vivo büyüme testlerinin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Bu protokoller son derece tekrarlanabilir veriler sağlar ve 3B kültür sistemleri için yaygın olarak uygulanabilir.
İlaç direnci kanser tedavisinde önemli klinik sorunlardan biridir. Metastatik prostat kanseri (PCa) tedavisi öncelikle androjen sinyal eksenine yöneliktir. Yeni nesil anti-androjen tedavileri (örneğin, enzalutamide ve abiraterone) büyük klinik başarı göstermiştir, ama hemen hemen tüm PCa sonunda bir androjen-bağımsız devlet doğru ilerler, ya da kastrasyona dirençli prostat kanseri (CRPC).
CRPC’nin son genomik ve transkripsiyon profili prostat kanserinde üç genel direnç mekanizması olduğunu ortaya koymuştur: 1) androjen reseptörünün (AR)sinyalizasyonuile sonuçlanan mutasyonları aktive eder 1; 2) bypass sinyalaktivasyonu, yeni nesil anti-androjen tedavi direnci için bir ön klinik modelde örneklendiği gibi hangi glukokortikoid reseptöraktivasyonu (GR) AR sinyal kaybı telafi edebilir2; ve 3) tümör hücrelerinin ilaç hedefine bağımlı bir hücre tipinden buna bağımlı olmayan başka bir hücre tipine geçiş yaparak direnç kazandığı soy plastisite süreci (PCa’da AR-negatif olarak temsil edilir) ve/veya nöroendokrin hastalık [NEPC])3,4. Ancak, ilaç direncine neden olan moleküler mekanizmalar anlaşılamamıştır. Ayrıca, edinsel anti-androjen direnci yararlanılabilir terapötik güvenlik açıklarına yol açabilir. Bu nedenle, hasta fenotiplerini ve genotipleri taklit eden model sistemlerde ilaç yanıtlarını değerlendirmek esastır.
Prostat organoidleri tanımlanmış bir ortama sahip 3Boyutlu protein matrisinde yetişen organotipik kültürlerdir. Daha da önemlisi, prostat organoidler murin veya insan kökenli iyi huylu ve kanserli doku kurulabilir, ve onlar in vivo bulunan henotypic ve genotypik özellikleri korumak5,6. Daha da önemlisi, hem anti-androjen duyarlı PCa ve CRPC hücreleri organoidlerin mevcut özet temsil edilmektedir. Ayrıca, prostat organoidleri kolayca genetik CRISPR /Cas9 ve shRNA5kullanılarak manipüle edilir. Bu nedenle, prostat organoidleri ilaç yanıtlarını test etmek ve direnç mekanizmalarını açıklamak için uygun bir model sistemdir. Burada, prostat organoidleri kullanarak ilaç testi yapmak ve farmakolojik yanıtları analiz etmek için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.
Anti-androjen direncinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması ve potansiyel terapötik zayıflıkların keşfedilmesi, prostat kanserini taklit eden model sistemlerde farmakolojik yanıtların test edilmesini gerektirir. Burada açıklanan hasta kaynaklı ve genetiği değiştirilmiş prostat organoidlerinde farmakolojik yanıtların güvenilir analizi ve bu organoid örneklerinin downstream uygulamaları için hazırlanması için ayrıntılı bir protokoldür.
Bu protokol…
The authors have nothing to disclose.
K.P. NIH 1F32CA236126-01 tarafından desteklenir. C.L.S. HHMI tarafından desteklenir; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; ve Starr Kanser Konsorsiyumu. W.R.K. Hollanda Kanser Vakfı/KWF Buit 2015-7545 ve Prostat Kanseri Vakfı PCF 17YOUN10 tarafından destekleniyor.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |