遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養
Summary
ここで提示する前立腺上皮オルガノイドにおける薬理学的応答を研究するためのプロトコルである。オルガノイドは生体内生物学によく似ており、患者の遺伝学を再現し、魅力的なモデルシステムとなっています。前立腺オルガノイドは、野生型前立腺、遺伝子操作されたマウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。
Abstract
ここで提示するプロトコルは、前立腺上皮オルガノイドにおける薬力学、幹細胞電位、および癌分化を研究するためのプロトコルである。前立腺オルガノイドは、前立腺上皮に似た定義された培地で成長したアンドロゲン応答性の3次元(3D)培養物である。前立腺オルガノイドは、野生型および遺伝子操作マウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。重要なことに、患者由来のオルガノイドは遺伝学および生体内腫瘍生物学の腫瘍によく似ている。さらに、オルガノイドはCRISPR/Cas9およびshRNAシステムを使用して遺伝的に操作することができる。これらの制御遺伝学は、ゲノム型および突然変異プロファイルが薬理学的応答に及ぼす影響を迅速に検査するためのプラットフォームとしてオルガノイド培養を魅力的にする。しかし、実験プロトコルは、再現可能な結果を得るために、オルガノイド培養物の3D性質に特異的に適合する必要があります。ここで説明する詳細なプロトコルは、オルガノイド形成能力を決定するために播種アッセイを行うための。その後、このレポートは、薬剤治療を行い、生存率測定、タンパク質分離、およびRNA単離を介して薬理学的応答を分析する方法を示す。最後に、このプロトコルは、皮下移植を用いて異種移植およびその後の生体内成長アッセイのためのオルガノイドを調製する方法を記述する。これらのプロトコルは、再現性の高いデータを生成し、3Dカルチャーシステムに広く適用可能です。
Introduction
薬剤耐性は、がん治療における主要な臨床問題の一つです。転移性前立腺癌(PCa)治療は、主にアンドロゲンシグナル伝達軸に向けられる。次世代の抗アンドロゲン療法(例えば、エンザルタミドおよびアビラテロン)は大きな臨床的成功を示したが、事実上すべてのPCaは最終的にアンドロゲン非依存状態、または去勢耐性前立腺癌(CRPC)に向かって進行する。
CRPCの最近のゲノムおよび転写プロファイリングは、前立腺癌における抵抗性の3つの一般的なメカニズムがあることを明らかにした:1)アンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達1の回復をもたらす突然変異を活性化する;2)バイパスシグナル伝達の活性化は、グルココルチコイド受容体(GR)の活性化がARシグナル伝達2の損失を補償することができる次世代抗アンドロゲン療法抵抗のための前臨床モデルで例示されるように;そして3)最近同定された系統可塑性の過程で、腫瘍細胞が薬物標的に依存する細胞型からこれに依存しない別の細胞型に系統を切り替えて抵抗性を獲得する(PCaでは、AR陰性として表される)および/または神経内分泌疾患 [NEPC])3,4.しかしながら、薬剤耐性を引き起こす分子機構は理解されていない。さらに、獲得した抗アンドロゲン耐性は、悪用され得る治療上の脆弱性につながる可能性があります。したがって、患者の表現型および遺伝子型を模倣するモデルシステムにおける薬物応答を評価することが不可欠である。
前立腺オルガノイドは、定義された培地を有する3Dタンパク質マトリックス中で成長した組織異性培養物である。重要なことに、前立腺オルガノイドは、マウスまたはヒト起源の良性および癌組織から確立することができ、それらは生体内5、6に見られる形膜および遺伝性特徴を保持する。重要なことに、抗アンドロゲン感受性PCaおよびCRPC細胞の両方がオルガノイドの現在のコンペンディウムで表される。さらに、前立腺オルガノイドはCRISPR/Cas9およびshRNA5を使用して容易に遺伝的に操作される。したがって、前立腺オルガノイドは、薬物応答を試験し、抵抗機構を解明するための適切なモデルシステムである。ここでは、薬物検査を行い、前立腺オルガノイドを用いて薬理学的応答を分析するための詳細なプロトコルについて説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
抗アンドロゲン耐性の基礎となる分子機構を理解し、潜在的な治療上の脆弱性を発見するには、前立腺癌を模倣したモデル系における薬理学的応答の検査が必要です。ここで説明する詳細なプロトコルは、患者由来および遺伝子操作された前立腺オルガノイドにおける薬理学的応答の信頼性の高い分析と、下流アプリケーション用のこれらのオルガノイドサンプルの調製のための詳細なプロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.P. は NIH 1F32CA236126-01 によってサポートされています。C.L.S. は HHMI によってサポートされています。CA193837;CA092629;CA224079;CA155169;CA008748;そしてスターがんコンソーシアム。W.R.K.はオランダ癌財団/KWF Buit 2015-7545と前立腺癌財団PCF 17YOUN10によってサポートされています。
Materials
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
