Cultivos organoides de próstata como herramientas para traducir genotipos y perfiles mutacionales a respuestas farmacológicas
Summary
Aquí se presenta un protocolo para estudiar las respuestas farmacológicas en organoides epiteliales de próstata. Los organoides se asemejan mucho a la biología in vivo y recapitulan la genética de los pacientes, convirtiéndolos en atractivos sistemas de modelos. Los organoides de próstata se pueden establecer a partir de próstatas de tipo salvaje, modelos de ratón genéticamente diseñados, tejido humano benigno y cáncer de próstata avanzado.
Abstract
Se presenta aquí un protocolo para estudiar la farmacodinámica, el potencial de las células madre y la diferenciación del cáncer en los organoides epiteliales de la próstata. Los organoides de próstata son cultivos tridimensionales (3D) sensibles a los andrógenos cultivados en un medio definido que se asemeja al epitelio prostático. Los organoides de próstata se pueden establecer a partir de modelos de ratón de tipo salvaje y genéticamente diseñados, tejido humano benigno y cáncer de próstata avanzado. Es importante destacar que los organoides derivados del paciente se asemejan mucho a los tumores en la genética y la biología tumoral in vivo. Además, los organoides pueden manipularse genéticamente utilizando sistemas CRISPR/Cas9 y shRNA. Estas genéticas controladas hacen que el cultivo organoide sea atractivo como plataforma para probar rápidamente los efectos de los genotipos y perfiles mutacionales en las respuestas farmacológicas. Sin embargo, los protocolos experimentales deben adaptarse específicamente a la naturaleza 3D de los cultivos organoides para obtener resultados reproducibles. Aquí se describen protocolos detallados para realizar ensayos de sembrado para determinar la capacidad de formación de organoides. Posteriormente, este informe muestra cómo realizar tratamientos farmacológicos y analizar la respuesta farmacológica a través de mediciones de viabilidad, aislamiento de proteínas y aislamiento de ARN. Por último, el protocolo describe cómo preparar organoides para xenografting y posteriores ensayos de crecimiento in vivo utilizando injertosub. Estos protocolos producen datos altamente reproducibles y son ampliamente aplicables a los sistemas de cultivo 3D.
Introduction
La resistencia a los medicamentos es uno de los principales problemas clínicos en el tratamiento del cáncer. El tratamiento del cáncer de próstata metastásico (PCa) se dirige principalmente al eje de señalización de andrógenos. Las terapias antiandrógenas de última generación (p. ej., enzalutamida y abiraterona) han demostrado un gran éxito clínico, pero prácticamente toda la PCa eventualmente progresa hacia un estado independiente de los andrógenos, o cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).
El perfil genómico y transcriptomico reciente de CRPC reveló que hay tres mecanismos generales de resistencia en el cáncer de próstata: 1) activando mutaciones que resultan en la restauración del receptor de andrógenos (AR) señalización1; 2) activación de la señalización de derivación, como se ejemplifica en un modelo preclínico para la resistencia a la terapia antiandrógeno de próxima generación en la que la activación del receptor de glucocorticoides (GR) puede compensar la pérdida de la señalización AR2; y 3) el proceso recientemente identificado de plasticidad del linaje, en el que las células tumorales adquieren resistencia cambiando los linajes de un tipo de célula dependiente del objetivo del fármaco a otro tipo de célula que no depende de esto (que, en PCa, se representa como AR negativo y/o enfermedad neuroendocrina [NEPC])3,4. Sin embargo, no se entienden los mecanismos moleculares que causan resistencia a los fármacos. Por otra parte, resistencia antiandrógeno adquirida puede conducir a vulnerabilidades terapéuticas que pueden ser explotados. Por lo tanto, es esencial evaluar las respuestas de los medicamentos en sistemas modelo que imitan los fenotipos y genotipos del paciente.
Los organoides de próstata son cultivos organotípicos cultivados en una matriz de proteína 3D con un medio definido. Es importante destacar que los organoides de próstata se pueden establecer a partir de tejido benigno y canceroso de origen murino u humano, y conservan rasgos fenotípicos y genotípicos que se encuentran en vivo5,6. Es importante destacar que las células PCa y CRPC sensibles a los antiandrógenos están representadas en el compendio actual de organoides. Además, los organoides de próstata se manipulan genéticamente fácilmente utilizando CRISPR/Cas9 y shRNA5. Por lo tanto, los organoides de próstata son un sistema modelo adecuado para probar las respuestas de los medicamentos y dilucidar los mecanismos de resistencia. Aquí, se describe un protocolo detallado para realizar pruebas de drogas y analizar las respuestas farmacológicas utilizando organoides de próstata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia a los antiandrógenos y descubrir posibles vulnerabilidades terapéuticas requiere pruebas de respuestas farmacológicas en sistemas modelo que imitan el cáncer de próstata. Aquí se describe un protocolo detallado para el análisis fiable de las respuestas farmacológicas en organoides de próstata derivados del paciente y genéticamente diseñados y la preparación de estas muestras de organoides para aplicaciones posteriores.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
K.P. es compatible con NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. es compatible con HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; y Starr Cancer Consortium. W.R.K. cuenta con el apoyo de Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 y Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.
Materials
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
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