المقدمة هنا هو بروتوكول لدراسة الاستجابات الدوائية في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. العضوية تشبه بشكل وثيق في علم الاحياء الحيوي وتلخيص علم الوراثة المريض ، مما يجعلها نظم نموذج جذابة. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من البروستات البرية ، ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة.
المعروض هنا هو بروتوكول لدراسة دوائي ، والخلايا الجذعية المحتملة ، والتمايز السرطان في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. البروستاتا العضوي هي الاندروجين استجابه ، ثلاثية الابعاد (3D) الثقافات المزروعة في المتوسطة المحددة التي تشبه ظهاره البروستاتا. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من النوع البري ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة. الأهم من ذلك ، المريض العضوي المشتقة يشبه بشكل وثيق الأورام في علم الوراثة والبيولوجيا الورم الجسم الحيوي. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون التلاعب العضوي وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 ونظم شرانا. هذه الوراثة الخاضعة للرقابة تجعل الثقافة العضوية جذابة كمنصة للاختبار السريع لأثار الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية علي الاستجابات الدوائية. ومع ذلك ، يجب ان تتكيف البروتوكولات التجريبية علي وجه التحديد مع الطبيعة ثلاثية الابعاد للثقافات العضوية للحصول علي نتائج قابله للتكرار. الموصوفة هنا هي بروتوكولات مفصله لأداء اختبارات البذر لتحديد قدره تشكيل العضوية. وفي وقت لاحق ، يظهر هذا التقرير كيفيه اجراء العلاجات الدوائية وتحليل الاستجابة الصيدلانية عن طريق قياسات القدرة علي البقاء ، وعزل البروتين ، وعزل الجيش النيبالي الريبي. وأخيرا ، يصف البروتوكول كيفيه تحضير العضو العضوي لتطعيم الجسم وبعد ذلك في اختبارات النمو المجرية باستخدام التطعيم تحت الجلد. وتسفر هذه البروتوكولات عن بيانات عاليه الاستنساخ وتنطبق علي نطاق واسع علي نظم الثقافة ثلاثية الابعاد.
مقاومه المخدرات هي واحده من المشاكل السريرية الرئيسية في علاج السرطان. ويوجه العلاج سرطان البروستاتا المنتشر (PCa) في المقام الأول علي محور الإشارات الاندروجين. الجيل التالي من العلاجات المضادة للالاندروجين (علي سبيل المثال ، enzalutamide و abiraterone) وقد أظهرت نجاحا كبيرا السريرية ، ولكن تقريبا جميع الانيسول الخماسي الكلور في نهاية المطاف تتقدم نحو دوله مستقله الاندروجين ، أو التطهير البروستات المقاوم للسرطان (CRPC).
كشفت الجينوم الحديثة والتنميط الناسخ من CRPC هناك ثلاث أليات عامه للمقاومة في سرطان البروستاتا: 1) تنشيط الطفرات الناتجة عن استعاده مستقبلات الاندروجين (AR) يشير1; 2) تفعيل الإشارات التفافيه ، كما هو مثال في نموذج ما قبل السريرية للجيل القادم المضادة للمقاومة الاندروجين المقاومة التي تنشيط مستقبلات جلوكورتيكويد (GR) يمكن ان تعوض عن فقدان الإشارات AR2؛ و 3) العملية التي تم التعرف عليها مؤخرا من اللدونة السلالة ، التي الخلايا السرطانية الحصول علي المقاومة عن طريق تحويل السلالات من نوع الخلية تعتمد علي الهدف المخدرات إلى نوع آخر من الخلايا التي لا تعتمد علي هذا (والتي ، في الانيسول الخماسي الكلور ، ويتم تمثيل السلبية و/أو مرض الغدد الصماء العصبية [nepc])3،4. ومع ذلك ، فان أليات الجزيئية التي تسبب مقاومه المخدرات ليست مفهومه. وعلاوة علي ذلك, المقاومة المكتسبة الاندروجين المضادة قد يؤدي إلى نقاط الضعف العلاجية التي يمكن استغلالها. ولذلك ، من الضروري تقييم الاستجابات الدوائية في النظم النموذجية التي تحاكي الأنماط الظاهرية للمرضي والأنماط الجينية.
البروستاتا العضوي هي ثقافات التنميط العضوي المزروعة في مصفوفة بروتين ثلاثي الابعاد مع متوسط محدد. الأهم من ذلك ، يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من الانسجه الحميدة والسرطانية من murine أو الأصل البشري ، وانها تحتفظ السمات الظاهرية والجينية الميزات الموجودة في فيفو5،6. الأهم من ذلك ، يتم تمثيل كل من الخلايا الحساسة المضادة للالاندروجين و CRPC في الخلاصة الحالية للارغيدات. وعلاوة علي ذلك ، يتم التلاعب العضوي البروستاتا بسهوله وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 و شرينا5. وهكذا ، organoids البروستاتا هي نظام نموذجي مناسب لاختبار الاستجابات المخدرات وتوضيح أليات المقاومة. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لاجراء اختبار المخدرات وتحليل الاستجابات الدوائية باستخدام organoids البروستاتا.
فهم أليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومه الاندروجين المضادة واكتشاف الثغرات العلاجية المحتملة يتطلب اختبار الاستجابات الدوائية في أنظمه نموذجيه محاكاة سرطان البروستاتا. وصف هنا هو بروتوكول مفصل لتحليل موثوق بها من الاستجابات الدوائية في البروستاتا المستمدة من المريض والمهندسة وراثيا و?…
The authors have nothing to disclose.
ويدعم ك من قبل المعاهد القومية للصحة 1F32CA236126-01. C.L.S. التي تدعمها المذكرة ؛ CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; وستار السرطان كونسورتيوم. W.R.K. معتمد من قبل مؤسسه السرطان الهولندية/KWF Buit 2015-7545 ومؤسسه سرطان البروستاتا PCF 17YOUN10.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |