Apresentado aqui é um protocolo para estudar as respostas farmacológicas em organóides epitelia da próstata. Organóides se assemelham à biologia in vivo e recapitulam a genética do paciente, tornando-os sistemas modelo atraentes. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de próstatas wildtype, modelos de camundongos geneticamente modificados, tecido humano benigno, e câncer de próstata avançado.
Apresentado aqui é um protocolo para estudar farmacodinâmica, potencial de células-tronco e diferenciação de câncer em organóides epitelia da próstata. Organóides da próstata são culturas orrógenas e tridimensionais (3D) cultivadas em um meio definido que se assemelha ao epitélio prostático. Organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem e geneticamente modificados, tecido humano benigno e câncer de próstata avançado. Importante, os organóides derivados pacientes assemelham-se pròxima a tumores na genética e na biologia in vivo do tumor. Além disso, os organóides podem ser manipulados geneticamente usando sistemas CRISPR/Cas9 e shRNA. Essas genéticas controladas tornam a cultura organóide atraente como uma plataforma para testar rapidamente os efeitos dos genótipos e perfis mutacionais nas respostas farmacológicas. No entanto, os protocolos experimentais devem ser especificamente adaptados à natureza 3D das culturas organóides para obter resultados reprodutíveis. Descritos aqui são protocolos detalhados para a realização de ensaios de semeada para determinar a capacidade de formação organóide. Posteriormente, este relatório mostra como realizar tratamentos medicamentosos e analisar a resposta farmacológica através de medições de viabilidade, isolamento de proteínas e isolamento de RNA. Finalmente, o protocolo descreve como preparar organóides para xenoenxerto e subsequentes ensaios de crescimento in vivo usando enxerto subcutâneo. Esses protocolos produzem dados altamente reproduzíveis e são amplamente aplicáveis a sistemas de cultura 3D.
A resistência aos medicamentos é um dos principais problemas clínicos no tratamento do câncer. O tratamento metastático do câncer de próstata (PCa) é direcionado principalmente para o eixo de sinalização de andrógenos. Terapias anti-andrógenos de última geração (por exemplo, enzalutamida e abiraterona) mostraram grande sucesso clínico, mas praticamente todas as PCa eventualmente progridem em direção a um estado independente de andrógeno, ou câncer de próstata resistente à castração (CRPC).
Perfil genômico e transcriptômico recente do CRPC revelou que existem três mecanismos gerais de resistência no câncer de próstata: 1) ativando mutações, resultando na restauração do receptor andrógeno (AR) sinalização1; 2) ativação da sinalização de bypass, como exemplificado em um modelo pré-clínico para a resistência à terapia anti-andrógeno de última geração em que a ativação do receptor glicocorticoide (GR) pode compensar a perda de sinalização ar2; e 3) o processo recentemente identificado de plasticidade da linhagem, em que as células tumorais adquirem resistência ao alternar linhagens de um tipo de célula dependente do alvo da droga para outro tipo de célula que não depende disso (que, em PCa, é representado como AR-negativo e/ou doença neuroendócrina [NEPC])3,4. No entanto, os mecanismos moleculares que causam resistência aos medicamentos não são compreendidos. Além disso, a resistência antiandrógena adquirida pode levar a vulnerabilidades terapêuticas que podem ser exploradas. Portanto, é essencial avaliar as respostas de medicamentos em sistemas modelo que imitam fenótipos e genótipos de pacientes.
Organóides da próstata são culturas organotípicas cultivadas em uma matriz de proteína 3D com um meio definido. Importante, organóides da próstata podem ser estabelecidos a partir de tecido benigno e canceroso de urina ou origem humana, e eles mantêm características erofópicas e genotípicas encontradas in vivo5,6. É importante ressaltar que tanto as células sensíveis ao PCa e crpc antiandrógenas estão representadas no atual compêndio de organóides. Além disso, os organóides da próstata são facilmente manipulados geneticamente usando CRISPR/Cas9 e shRNA5. Assim, organóides da próstata são um sistema modelo adequado para testar respostas de medicamentos e elucidar mecanismos de resistência. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para realizar testes de drogas e analisar as respostas farmacológicas usando organóides da próstata.
Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à resistência antiandrógena e descobrir potenciais vulnerabilidades terapêuticas requer testes de respostas farmacológicas em sistemas modelo que imitem o câncer de próstata. Descrito aqui é um protocolo detalhado para a análise confiável das respostas farmacológicas em organóides de próstata derivados e geneticamente modificados do paciente e a preparação dessas amostras organóides para aplicações a jusante.
Há dois passos c…
The authors have nothing to disclose.
K.P. é apoiado pelo NIH 1F32CA236126-01. A C.L.S. é apoiada pela HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; e Starr Cancer Consortium. W.R.K. é apoiado pela Dutch Cancer Foundation/KWF Buit 2015-7545 e pela Prostate Cancer Foundation PCF 17YOUN10.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |