여기에 제시된 것은 전립선 상피 오르가노이드의 약리학적 반응을 연구하는 프로토콜이다. 오르가노이드는 생체 생물학과 밀접하게 유사하며 환자 유전학을 재현하여 매력적인 모델 시스템을 만듭니다. 전립선 오르가노이드는 야생형 전립선, 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선암에서 확립될 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 전립선 상피 오르가노이드에서 약력학, 줄기 세포 전위 및 암 분화를 연구하는 프로토콜이다. 전립선 오르가노이드는 안드로겐 반응형 3차원(3D) 배양체로 전립선 피상과 유사한 정의된 배지에서 성장합니다. 전립선 오르가노이드는 야생 형 및 유전자 조작 마우스 모델, 양성 인간 조직 및 고급 전립선 암에서 확립 될 수 있습니다. 중요한 것은, 환자 유래 오르가노이드는 유전학과 생체 내 종양 생물학에 있는 종양을 밀접하게 닮습니다. 또한, 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA 시스템을 사용하여 유전자 조작이 가능합니다. 이 통제된 유전학은 약리학적인 반응에 유전형 그리고 돌연변이 단면도의 효력을 급속하게 시험하기 위한 단장으로 오르가노이드 문화를 매력적으로 만듭니다. 그러나, 실험 프로토콜은 재현 가능한 결과를 얻기 위하여 오르가노이드 문화의 3D 본질에 구체적으로 적응되어야 합니다. 여기서 설명된 것은 오르가노이드 형성 능력을 결정하기 위한 시딩 분석을 수행하기 위한 상세한 프로토콜이다. 그 후, 이 보고는 생존력 측정, 단백질 격리 및 RNA 격리를 통해 약물 치료를 수행하고 약리학적 반응을 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 프로토콜은 피하 이식을 사용하여 이종이식 및 후속 생체 내 성장 분석에 대한 오르가노이드를 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 매우 재현 가능한 데이터를 생성하며 3D 문화 시스템에 널리 적용됩니다.
약물 내성은 암 치료의 주요 임상 문제 중 하나입니다. 전이성 전립선암 (PCa) 치료는 주로 안드로겐 신호 전달 축을 지향한다. 차세대 항안드로겐 치료법(예: 엔잘루타미드 및 아비라테론)은 임상적으로 큰 성공을 보였지만, 사실상 모든 PCa는 결국 안드로겐 독립 국가 또는 거세 저항성 전립선암(CRPC)으로 진행됩니다.
CRPC의 최근 게놈 및 전사체 프로파일링은 전립선암에 내성의 세 가지 일반적인 메커니즘이 밝혀: 1) 안드로겐 수용체 (AR) 신호의 복원의 결과로 돌연변이를 활성화1; 2) 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 활성화가 AR 신호전달의 손실을 보상할 수 있는 차세대 항안드로겐 치료 저항에 대한 전임상 모델에서 예시된 바와 같이 바이패스 신호전달의활성화2; 및 3) 종양 세포가 약물 표적에 의존하는 세포 유형에서 이에 의존하지 않는 다른 세포 유형으로 혈통을 전환하여 내성을 획득하는 계보 가소성의 최근 확인된 과정 (PCa에서 AR 음성으로 표현됩니다). 및/또는 신경 내분비 질환 [NEPC])3,4. 그러나 약물 내성을 유발하는 분자 메커니즘은 이해되지 않습니다. 더욱이, 취득한 반대로 안드로겐 저항은 악용될 수 있는 치료 취약점으로 이끌어 낼 수 있습니다. 따라서 환자 표현형 및 유전자형을 모방하는 모델 시스템에서 약물 반응을 평가하는 것이 필수적입니다.
전립선 오르가노이드는 정의된 배지를 가진 3D 단백질 매트릭스에서 성장한 오르가노티컬 배양체이다. 중요한 것은, 전립선 오르가노이드는 뮤린 또는 인간 기원의 양성 및 암 조직에서 확립 될 수 있으며, 그들은생체5,6에서발견되는 자형질 및 지질 학적 특징을 유지한다. 중요한 것은, 항안드로겐 에 민감한 PCa 및 CRPC 세포는 모두 오르가노이드의 현재 보상에서 표현된다. 또한, 전립선 오르가노이드는 CRISPR/Cas9 및 shRNA5를사용하여 쉽게 유전자 조작됩니다. 따라서, 전립선 오르가노이드는 약물 반응을 테스트하고 내성 메커니즘을 해명하기 위한 적합한 모델 시스템이다. 여기서, 상세한 프로토콜은 약물 검사를 수행하고 전립선 오르가노이드를 사용하여 약리학적 반응을 분석하기 위해 기술된다.
항 안드로겐 저항의 근본적인 분자 기계장치를 이해하고 잠재적인 치료 취약성을 발견하려면 전립선암을 모방한 모델 시스템에서 약리학적 반응을 테스트해야 합니다. 여기서 설명된 상세한 프로토콜은 환자 유래 및 유전자 조작 전립선 오르가노이드및 다운스트림 애플리케이션을 위한 이러한 오르가노이드 샘플의 제조에서 약리학적 반응의 신뢰할 수 있는 분석을 위한 상세한 프로토콜이다.</…
The authors have nothing to disclose.
K.P.는 NIH 1F32CA236126-01에 의해 지원됩니다. C.L.S.는 HHMI에 의해 지원됩니다. CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; 스타 암 컨소시엄. W.R.K.는 네덜란드 암 재단 / KWF Buit 2015-7545 및 전립선 암 재단 PCF 17YOUN10에 의해 지원됩니다.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |