Hier gepresenteerd is een protocol om farmacologische reacties te bestuderen in prostaat epitheel organoïden. Organoïden lijken nauw in vivo biologie en even patiënt genetica, waardoor ze aantrekkelijk modelsystemen. Prostaat organoïden kunnen worden vastgesteld uit wild type prostates, genetisch gemanipuleerde muismodellen, goedaardig menselijk weefsel en gevorderde prostaatkanker.
Hier gepresenteerd is een protocol voor het bestuderen van farmacodynamica, stamcel potentieel, en kanker differentiatie in prostaat epitheel organoïden. Prostaat organoïden zijn androgeen responsieve, driedimensionale (3D) culturen geteeld in een gedefinieerd medium dat lijkt op het prostaat epitheel. Prostaat organoïden kunnen worden opgebouwd uit wild-type en genetisch gemanipuleerde muismodellen, goedaardig menselijk weefsel en gevorderde prostaatkanker. Belangrijk, patiënt afgeleide organoïden sterk lijken op tumoren in de genetica en in vivo tumor biologie. Bovendien kunnen organoïden genetisch gemanipuleerd worden met behulp van CRISPR/Cas9 en shRNA systemen. Deze gecontroleerde genetica maken de organoïde cultuur aantrekkelijk als een platform voor het snel testen van de effecten van genotypen en mutationele profielen op farmacologische reacties. Experimentele protocollen moeten echter specifiek worden aangepast aan de 3D-aard van organoïde culturen om reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Hier beschreven zijn gedetailleerde protocollen voor het uitvoeren van zaaien testen om te bepalen van de organoïde vorming capaciteit. Vervolgens laat dit rapport zien hoe u medicamenteuze behandelingen uitvoert en de farmacologische respons analyseert via de levensvatbaarheid metingen, eiwit isolatie en RNA-isolatie. Ten slotte wordt in het protocol beschreven hoe organoïden voor xenografting en daaropvolgende in vivo groei testen worden bereid met subcutane enten. Deze protocollen leveren zeer reproduceerbare gegevens op en zijn algemeen toepasbaar op 3D-kweeksystemen.
Resistentie tegen geneesmiddelen is een van de belangrijkste klinische problemen bij de behandeling van kanker. De behandeling met gemetastaseerde prostaatkanker (PCa) is primair gericht op de androgeen-signalering van de as. De volgende generatie anti-androgeen therapieën (bijv. enzalutamide en abirateron) hebben een groot klinisch succes aangetoond, maar vrijwel alle PCa vordert uiteindelijk in de richting van een androgeen onafhankelijke staat of castratieresistente prostaatkanker (CRPC).
Recente genomische en transcriptomische profilering van CRPC onthuld er zijn drie algemene mechanismen van resistentie bij prostaatkanker: 1) activerende mutaties resulterend in het herstel van de androgeen receptor (AR) signalering1; 2) activering van bypass signalering, zoals geïllustreerd in een pre-klinisch model voor de volgende generatie anti-androgeen therapie resistentie waarbij activering van de glucocorticoide receptor (GR) kan compenseren voor verlies van AR signalering2; en 3) het recent geïdentificeerde proces van de afstamming plasticiteit, waarin tumorcellen weerstand verwerven door het overschakelen van de lijn van een celtype afhankelijk van het doel van de drug naar een ander celtype dat niet afhankelijk is van deze (die, in PCa, wordt weergegeven als AR-negatieve en/of neuro-endocriene ziekte [nepc])3,4. Echter, de moleculaire mechanismen die drug resistentie veroorzaken zijn niet begrepen. Bovendien, verworven anti-androgeen resistentie kan leiden tot therapeutische kwetsbaarheden die kunnen worden uitgebuit. Daarom is het essentieel om te evalueren van drug reacties in modelsystemen die patiënten fenotypes en genotypes nabootsen.
Prostaat-organoïden zijn organotypische culturen die worden gekweekt in een 3D-eiwit matrix met een gedefinieerd medium. Belangrijk is dat prostaat organoïden kunnen worden vastgesteld uit goedaardig en kanker weefsel van Murine of menselijke oorsprong, en ze behouden fenotypische en genotypische kenmerken die in vivo5,6worden aangetroffen. Belangrijk is dat zowel de anti-androgeen gevoelige PCa-en CRPC-cellen worden vertegenwoordigd in het huidige compendium van organoïden. Bovendien zijn prostaat organoïden gemakkelijk genetisch gemanipuleerd met CRISPR/Cas9 en shRNA5. Dus, prostaat organoïden zijn een geschikt modelsysteem voor het testen van drug reacties en verhelderende resistentiemechanismen. Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om medicijn testen uit te voeren en farmacologische reacties te analyseren met behulp van prostaat organoïden.
Inzicht in de moleculaire mechanismen onderliggende anti-androgeen resistentie en het ontdekken van potentiële therapeutische kwetsbaarheden vereist testen van farmacologische reacties in modelsystemen nabootsen van prostaatkanker. Hier beschreven is een gedetailleerd protocol voor de betrouwbare analyse van farmacologische reacties bij patiënten afgeleide en genetisch gemanipuleerde prostaat organoïden en de bereiding van deze organoïde monsters voor downstreamtoepassingen.
Er zijn twee b…
The authors have nothing to disclose.
K.P. wordt ondersteund door NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. wordt ondersteund door HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; en Starr Cancer consortium. W.R.K. wordt ondersteund door de Nederlandse kanker Stichting/KWF buit 2015-7545 en de prostaatkanker Stichting PCF 17YOUN10.
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |