Summary

Monitoreo del pH extracelular en biopelículas entre reinos mediante microscopía confocal

Published: January 30, 2020
doi:

Summary

El protocolo describe el cultivo de biopelículas entre reinos consistentes en Candida albicans y Streptococcus mutans y presenta un método basado en microscopía confocal para el monitoreo del pH extracelular dentro de estas biopelículas.

Abstract

Las biopelículas entre reinos que consisten en células fúngicas y bacterianas están involucradas en una variedad de enfermedades bucales, como infecciones endodónticas, periodontitis, infecciones mucosas y, sobre todo, caries en la primera infancia. En todas estas condiciones, el pH en la matriz de biopelícula afecta las interacciones microbio-huésped y, por lo tanto, la progresión de la enfermedad. El presente protocolo describe un método basado en microscopía confocal para monitorear la dinámica de pH dentro de biopelículas entre reinos que comprenden Candida albicans y Streptococcus mutans. El espectro de doble emisión dependiente del pH y las propiedades de tinción de la sonda ratiométrica C-SNIF-4 se explotan para determinar las caídas de pH en áreas extracelulares de las biopelículas. El uso de la ratiometría de pH con la sonda requiere una elección meticulosa de parámetros de imagen, una calibración exhaustiva del tinte y un procesamiento posterior cuidadoso y basado en umbrales de los datos de la imagen. Cuando se utiliza correctamente, la técnica permite la evaluación rápida del pH extracelular en diferentes áreas de una biopelícula y, por lo tanto, el seguimiento de los gradientes de pH horizontales y verticales a lo largo del tiempo. Mientras que el uso de microscopía confocal limita el perfilado Z a biopelículas delgadas de 75 m o menos, el uso de ratiometría de pH es ideal para el estudio no invasivo de un factor de virulencia importante en biopelículas entre reinos.

Introduction

Las biopelículas entre reinos que comprenden especies fúngicas y bacterianas están involucradas en varias condiciones patológicas en la cavidad oral. Candida spp. se han aislado con frecuencia de infecciones endodónticas1 y de lesiones periodontales2,3. En las infecciones mucosas, se ha demostrado que las especies estreptocócicas del grupo de mitis mejoran la formación de biopelículas fúngicas, la invasión de tejidos y la diseminación tanto en los modelos in vitro como murinos4,5,6,7. Lo más interesante es que el transporte oral de Candida spp. ha demostrado estar asociado con la prevalencia de caries en niñosde 8años. Como se muestra en los modelos de roedores, una relación simbiótica entre Streptococcus mutans y Candidas albicans aumenta la producción de polisacáridos extracelulares y conduce a la formación de biopelículas más gruesas y cariogénicas9,10.

En todas las condiciones antes mencionadas, la caries de la primera infancia en particular, el pH de biopelícula es importante para la progresión de la enfermedad, y el papel eminente de la matriz de biopelículas para el desarrollo de microambientes acidogénicos11 requiere metodologías que permitan estudiar los cambios de pH dentro de las biopelículas entre reinos. Se han desarrollado enfoques simples y precisos basados en microscopía confocal para controlar el pH dentro de las biopelículas bacterianas12 y13 fúngicas. Con el tinte ratiométrico C-SNARF-4 y el postprocesamiento de imágenes basado en umbrales, el pH extracelular se puede determinar en tiempo real en las tres dimensiones de un biofilm14. En comparación con otras técnicas publicadas para el monitoreo de pH basado en microscopía en biopelículas, la ratiometría de pH con C-SNARF-4 es simple y barata, ya que no requiere la síntesis de partículas o compuestos que incluyan un tinte de referencia15 o el uso de la excitación de dos fotones16. El uso de un solo tinte evita problemas con la compartimentación de la sonda, el sangrado fluorescente y el blanqueo selectivo16,17,18, al tiempo que permite una diferenciación fiable entre el pH intra y extracelular. Finalmente, la incubación con el tinte se realiza después del crecimiento del biofilm, lo que permite estudiar tanto biopelículas cultivadas en laboratorio como in situ.

El objetivo del presente trabajo es ampliar el uso de la ratiometría de pH y proporcionar un método para estudiar los cambios de pH en las biopelículas entre reinos. Como prueba de concepto, el método se utiliza para monitorear el pH en biopelículas de dos especies compuestas por S. mutans y C. albicans expuestos a la glucosa.

Protocol

El protocolo para la recolección de saliva fue revisado y aprobado por el Comité de ética del condado de Aarhus (M-20100032). 1. Cultivo de Biopelículas entre reinos Cultivar S. mutans DSM 20523 y C. albicans NCPF 3179 en placas de agar en sangre a 37 oC en condiciones aeróbicas. Transfiera colonias individuales de cada organismo a tubos de ensayo llenos de 5 ml de infusión cardíaca cerebral (BHI). Crecer durante 18 h en condiciones aeróbicas a 37o…

Representative Results

Después de 24 h y 48 h, robustas biopelículas entre reinos desarrolladas en las placas de pozo. C. albicans mostró diferentes grados de crecimiento filamentoso, y S. mutans formó racimos densos de hasta 35 m de altura. Células y cadenas de S. mutans agrupadas alrededor de hifas fúngicas, y grandes espacios intercelulares indicaron la presencia de una matriz voluminosa(Figura S1). La calibración del tinte ratiométrico produce una curva sigmoid…

Discussion

Diferentes protocolos para el cultivo de biopelículas entre reinos con C. albicans y Streptococcus spp. han sido descritos previamente9,22,23,24,25. Sin embargo, la configuración actual se centra en condiciones de crecimiento simples, un cronograma compatible con días laborables regulares, una composición equilibrada de especies …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Anette Aakjor Thomsen y Javier E. García son reconocidos por su excelente soporte técnico. Los autores agradecen a Rubens Spin-Neto sus fructíferas discusiones sobre el análisis de imágenes.

Materials

Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

References

  1. Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
  2. Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
  3. De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
  4. Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
  5. Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
  6. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
  7. Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
  8. Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
  9. Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
  10. Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
  11. Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
  12. Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
  13. Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
  14. Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
  15. Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
  16. Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
  17. Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
  18. Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
  19. de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
  20. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  21. Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
  22. Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
  23. Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
  24. Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
  25. Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
  26. Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
  27. Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  28. Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
  29. Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
  30. Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
  31. Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
  32. Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).

Play Video

Cite This Article
Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

View Video