Surveillance du pH extracellulaire dans les biofilms Cross-Kingdom à l'aide de la microscopie confocale
Summary
Le protocole décrit la culture de biofilms inter-royaume s’composés de Candida albicans et Streptococcus mutans et présente une méthode confocale basée sur la microscopie pour la surveillance du pH extracellulaire à l’intérieur de ces biofilms.
Abstract
Les biofilms transversaux composés de cellules fongiques et bactériennes sont impliqués dans une variété de maladies buccales, telles que les infections endodontiques, la parodontite, les infections muqueuses et, plus particulièrement, les caries de la petite enfance. Dans toutes ces conditions, le pH de la matrice de biofilm influe sur les interactions microbe-hôte et donc la progression de la maladie. Le protocole actuel décrit une méthode à base de microscopie confocale pour surveiller la dynamique du pH à l’intérieur des biofilms transversaux comprenant Candida albicans et Streptococcus mutans. Le spectre à double émission dépendant du pH et les propriétés de coloration de la sonde ratiométrique C-SNARF-4 sont exploités pour déterminer les baisses de pH dans les zones extracellulaires des biofilms. L’utilisation de la ratiométrie de pH avec la sonde nécessite un choix méticuleux de paramètres d’imagerie, un étalonnage approfondi du colorant et un post-traitement minutieux basé sur le seuil des données d’image. Lorsqu’elle est utilisée correctement, la technique permet l’évaluation rapide du pH extracellulaire dans différentes zones d’un biofilm et donc la surveillance des gradients de pH horizontaux et verticaux au fil du temps. Alors que l’utilisation de la microscopie confocale limite le profilage Z à des biofilms minces de 75 m ou moins, l’utilisation de la ratiométrie du pH est idéalement adaptée à l’étude non invasive d’un facteur de virulence important dans les biofilms de l’ensemble du royaume.
Introduction
Les biofilms de cross-kingdom comprenant des espèces fongiques et bactériennes sont impliqués dans plusieurs conditions pathologiques dans la cavité buccale. Candida spp. ont souvent été isolés des infections endodontiques1 et des lésions parodontales2,3. Dans les infections muqueuses, les espèces streptococciques du groupe de mitis ont été montrées pour augmenter la formation de biofilm fongique, l’invasion de tissu, et la diffusion dans les modèles in vitro etmurines 4,5,6,7. Plus intéressant encore, le transport oral de Candida spp. a été prouvé pour être associé à la prévalence des caries chez les enfants8. Comme le montrent les modèles de rongeurs, une relation symbiotique entre Streptococcus mutans et Candidas albicans augmente la production de polysaccharides extracellulaires et conduit à la formation de biofilms plus épais et plus cariogéniques9,10.
Dans toutes les conditions susmentionnées, les caries de la petite enfance en particulier, le pH du biofilm est important pour la progression de la maladie, et le rôle éminent de la matrice biofilm pour le développement de microenvironnements acidogéniques11 exige des méthodologies qui permettent d’étudier les changements de pH à l’intérieur des biofilms inter-royaume. Des approches simples et précises basées sur la microscopie confocale pour surveiller le pH à l’intérieur des biofilmsbactériens 12 et fongiques13 ont été développées. Avec le colorant ratiométrique C-SNARF-4 et le post-traitement de l’image basé sur le seuil, le pH extracellulaire peut être déterminé en temps réel dans les trois dimensions d’un biofilm14. Comparé à d’autres techniques éditées pour la microscopie-basée pH-surveillance dans les biofilms, la ratiométrie de pH avec C-SNARF-4 est simple et bon marché, parce qu’elle ne nécessite pas la synthèse des particules ou des composés qui incluent un colorant de référence15 ou l’utilisation de l’excitation de deux-photon16. L’utilisation d’un seul colorant empêche les problèmes de compartimentation de sonde, de saignement fluorescent-à travers, et de blanchiment sélectif16,17,18 tout en permettant une différenciation fiable entre le pH intra- et extracellulaire. Enfin, l’incubation avec le colorant est effectuée après la croissance du biofilm, ce qui permet d’étudier à la fois les biofilms en laboratoire et in situ.
L’objectif du présent travail est d’étendre l’utilisation de la ratiométrie du pH et de fournir une méthode pour étudier les changements de pH dans les biofilms inter-royaume. Comme preuve de concept, la méthode est utilisée pour surveiller le pH dans les biofilms à deux espèces composés de S. mutans et De C. albicans exposés au glucose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Différents protocoles pour la culture de biofilms inter-royaume impliquant C. albicans et Streptococcus spp. ont été décrits précédemment9,22,23,24,25. Cependant, la configuration actuelle se concentre sur des conditions de croissance simples, un calendrier compatible avec les journées de travail régulières, une composition …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjor Thomsen et Javier E. Garcia sont reconnus pour leur excellent soutien technique. Les auteurs remercient Rubens Spin-Neto pour les discussions fructueuses sur l’analyse d’images.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
