Überwachung des extrazellulären pH-Werts in cross-kingdom Biofilmen mit Konfokalmikroskopie
Summary
Das Protokoll beschreibt den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen, die aus Candida-Albicans und Streptococcus-Mutanen bestehen, und stellt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung des extrazellulären pH-Werts in diesen Biofilmen dar.
Abstract
Reichübergreifende Biofilme, die aus Pilz- und Bakterienzellen bestehen, sind an einer Vielzahl von Oralerkrankungen beteiligt, wie endodontische Infektionen, Parodontitis, Schleimhautinfektionen und vor allem frühkindliche Karies. Unter all diesen Bedingungen wirkt sich der pH-Wert in der Biofilmmatrix auf Mikroben-Wirt-Wechselwirkungen und damit auf das Krankheitsverlauf aus. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine konfokale Mikroskopie-basierte Methode zur Überwachung der pH-Dynamik innerhalb königreichübergreifender Biofilme, die Candida-Albicans und Streptococcus-Mutane umfassen. Das pH-abhängige Dual-Emissions-Spektrum und die Färbeeigenschaften der ratiometrischen Sonde C-SNARF-4 werden genutzt, um pH-Tropfen in extrazellulären Bereichen der Biofilme zu bestimmen. Die Verwendung der pH-Ratiometrie mit der Sonde erfordert eine sorgfältige Auswahl der bildgebenden Parameter, eine gründliche Kalibrierung des Farbstoffs und eine sorgfältige, schwellenbasierte Nachbearbeitung der Bilddaten. Bei richtiger Verwendung ermöglicht die Technik die schnelle Beurteilung des extrazellulären pH-Werts in verschiedenen Bereichen eines Biofilms und damit die Überwachung von horizontalen und vertikalen pH-Gradienten im Zeitverlauf. Während die Verwendung der konfokalen Mikroskopie die Z-Profilierung auf dünne Biofilme von 75 m oder weniger beschränkt, eignet sich die Verwendung der pH-Ratiometrie ideal für die nichtinvasive Untersuchung eines wichtigen Virulenzfaktors in reichübergreifenden Biofilmen.
Introduction
Reichübergreifende Biofilme, die sowohl Pilz- als auch Bakterienarten umfassen, sind an mehreren pathologischen Erkrankungen in der Mundhöhle beteiligt. Candida spp. wurden häufig von endodontischen Infektionenisoliert 1 und von parodontalen Läsionen2,3. Bei Schleimhautinfektionen haben Streptokokkenarten aus der Mitis-Gruppe gezeigt, dass sie die Bildung von Pilzbiofilm, die Gewebeinvasion und die Verbreitung in den In-vitro- und Murine-Modellen4,5,6,7verbessern. Am interessantesten ist, mündliche Beförderung von Candida spp. hat sich als mit der Prävalenz von Karies bei Kindernverbunden 8. Wie in Nagetiermodellen gezeigt, erhöht eine symbiotische Beziehung zwischen Streptococcus mutans und Candidas albicans die Produktion von extrazellulären Polysacchariden und führt zur Bildung dickerer und karogener Biofilme9,10.
Unter allen oben genannten Bedingungen, insbesondere frühkindlichen Karies, ist der pH-Wert des Biofilms von Bedeutung für die Krankheitsprogression, und die herausragende Rolle der Biofilmmatrix für die Entwicklung von säureogenen Mikroumgebungen11 erfordert Methoden, die die Untersuchung von pH-Veränderungen innerhalb von bio-kingdomübergreifenden Biofilmen ermöglichen. Es wurden einfache und genaue konfokale Mikroskopie-basierte Ansätze zur Überwachung des pH-Werts in bakteriellen12 undPilz13 Biofilmen entwickelt. Mit dem ratiometrischen Farbstoff C-SNARF-4 und der schwellenbasierten Bildnachbearbeitung kann der extrazelluläre pH in Echtzeit in allen drei Dimensionen eines Biofilms14bestimmt werden. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Techniken zur mikroskopischen pH-Überwachung in Biofilmen ist die pH-Ratiometrie mit C-SNARF-4 einfach und kostengünstig, da sie nicht die Synthese von Partikeln oder Verbindungen erfordert, die einen Referenzfarbstoff15 oder die Verwendung von Zwei-Photonen-Erregung16enthalten. Die Verwendung von nur einem Farbstoff verhindert Probleme mit der Sondenkomdtalisation, fluoreszierenden Durchblutungen und selektivem Bleichen16,17,18 und ermöglicht gleichzeitig eine zuverlässige Differenzierung zwischen intra- und extrazellulärem pH-Wert. Schließlich erfolgt die Inkubation mit dem Farbstoff nach dem Biofilmwachstum, das es ermöglicht, sowohl Labor- als auch in situ-gewachsene Biofilme zu untersuchen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Verwendung der pH-Ratiometrie zu erweitern und eine Methode zur Untersuchung von pH-Veränderungen in grenzüberschreitenden Biofilmen bereitzustellen. Als Proof of Concept wird die Methode zur Überwachung des pH-Werts in Biofilmen mit zwei Arten, bestehend aus S. Mutans und C. albicans, die Glukose ausgesetzt sind, verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene Protokolle für den Anbau von königreichübergreifenden Biofilmen mit C. albicans und Streptococcus spp. wurdenzuvor9,22,23,24,25beschrieben. Das derzeitige Setup konzentriert sich jedoch auf einfache Wachstumsbedingungen, einen Zeitplan, der mit regulären Arbeitstagen kompatibel ist, eine ausgewogene Artenzusammensetz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Für den hervorragenden technischen Support wurden Anette Aakjér Thomsen und Javier E. Garcia ausgezeichnet. Die Autoren danken Rubens Spin-Neto für fruchtbare Diskussionen zur Bildanalyse.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
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