Summary

Monitoramento de pH extracelular em biofilmes transversais usando microscopia confocal

Published: January 30, 2020
doi:

Summary

O protocolo descreve o cultivo de biofilmes transversais compostos por candida albicans e streptococcus mutans e apresenta um método confocal baseado em microscopia para o monitoramento de pH extracelular dentro desses biofilmes.

Abstract

Biofilmes transversais que consistem em células fúngicas e bacterianas estão envolvidos em uma variedade de doenças bucais, como infecções endodônticas, periodontite, infecções mucosas e, mais notavelmente, cárinos da primeira infância. Em todas essas condições, o pH na matriz biofilme impacta as interações microbe-hospedeiros e, portanto, a progressão da doença. O protocolo atual descreve um método confocal baseado em microscopia para monitorar a dinâmica do PH dentro de biofilmes entre reinos compostos por candida albicans e streptococcus mutans. O espectro de emissão dupla dependente de pH e as propriedades de coloração da sonda ratiométrica C-SNARF-4 são explorados para determinar quedas no pH em áreas extracelulares dos biofilmes. O uso de ratiometria pH com a sonda requer uma escolha meticulosa de parâmetros de imagem, uma calibração completa do tintura e pós-processamento cuidadoso e baseado em limiar dos dados de imagem. Quando utilizada corretamente, a técnica permite a rápida avaliação do pH extracelular em diferentes áreas de um biofilme e, portanto, o monitoramento de gradientes pH horizontais e verticais ao longo do tempo. Embora o uso de microscopia confocal limite o perfil z a biofilmes finos de 75 μm ou menos, o uso de ratiometria pH é idealmente adequado para o estudo não invasivo de um importante fator de virulência em biofilmes entre reinos.

Introduction

Biofilmes entre reinos compostos por espécies fúngicas e bacterianas estão envolvidos em várias condições patológicas na cavidade oral. Candida spp. tem sido frequentemente isolada de infecções endodônticas1 e de lesões periodontais2,3. Em infecções mucosas, espécies estreptocócicas do grupo de áciculos têm sido mostradas para melhorar a formação fungal de biofilme, invasão de tecidos e disseminação nos modelos in vitro e murina4,5,6,7. Mais interessante, o transporte oral de Candida spp. tem sido comprovado estar associado à prevalência de cáios em crianças8. Como mostrado nos modelos de roedores, uma relação simbiótica entre mutanos streptococcus e candidas albicans aumenta a produção de polissacarídeos extracelulares e leva à formação de biofilmes mais grossos e cariogênicos9,10.

Em todas as condições acima mencionadas, as cárinas da primeira infância, em particular, o pH biofilme é importante para a progressão da doença, e o papel eminente da matriz biocinematográfica para o desenvolvimento de microambientes acidogênicos11 exige metodologias que permitam estudar mudanças de pH dentro de biofilmes transfronteiriços. Abordagens simples e precisas baseadas em microscopia confocal para monitorar pH dentro de biofilmes bacterianos12 e fúngicos13 foram desenvolvidas. Com o dye ratiométrico C-SNARF-4 e o pós-processamento de imagem baseado em limiares, o pH extracelular pode ser determinado em tempo real em todas as três dimensões de um biofilme14. Em comparação com outras técnicas publicadas para monitoramento de pH baseado em microscopia em biofilmes, a ratiometria de pH com C-SNARF-4 é simples e barata, pois não requer a síntese de partículas ou compostos que incluem um tintura de referência15 ou o uso de excitação de dois fótons16. O uso de apenas um corante evita problemas com compartimentação de sondas, sangramento fluorescente e branqueamento seletivo16,17,18, enquanto ainda permite uma diferenciação confiável entre pH intra e extracelular. Finalmente, a incubação com o tintura é realizada após o crescimento do biofilme, que permite estudar tanto laboratório quanto em biofilmes cultivados no situ.

O objetivo do presente trabalho é ampliar o uso da ratiometria de pH e fornecer um método para estudar mudanças de pH em biofilmes inter-reinos. Como prova de conceito, o método é usado para monitorar pH em biofilmes de espécies duplas compostas por s. mutans e c. albicans expostos à glicose.

Protocol

O protocolo para coleta de saliva foi revisto e aprovado pelo Comitê de Ética do Condado de Aarhus (M-20100032). 1. Cultivo de Biofilmes transfronteiriços Grow S. mutans DSM 20523 e C. albicans NCPF 3179 em placas de agar de sangue a 37 °C em condições aeróbicas. Transfira colônias individuais de cada organismo para testar tubos preenchidos com 5 mL de infusão cardíaca cerebral (BHI). Cresça por 18 h em condições aeróbicas a 37 °C. <li…

Representative Results

Após 24h e 48 h, biofilmes robustos de cross-kingdom se desenvolveram nas placas de poço. Os albicanos mostraram diferentes graus de crescimento de filamentous, e os mutanos formaram aglomerados densos de até 35 μm de altura. Células únicas e correntes de s. mutanos agrupados em torno de hífofas fúngicas, e grandes espaços intercelulares indicaram a presença de uma matriz volumosa (Figura S1). A calibração do tye ratiométrico produz uma …

Discussion

Diferentes protocolos para o cultivo de biofilmes transcionais envolvendo C. albicans e Streptococcus spp. foram descritos anteriormente9,22,23,24,25. No entanto, a configuração atual se concentra em condições simples de crescimento, um cronograma compatível com dias de trabalho regulares, uma composição de espécies equilibra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Anette Aakjær Thomsen e Javier E. Garcia são reconhecidos por excelente suporte técnico. Os autores agradecem a Rubens Spin-Neto por discussões frutíferas sobre análise de imagens.

Materials

Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A

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Cite This Article
Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).

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