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Immunology and Infection

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

Published: January 30, 2020
doi:
10.3791/60270
,
1Department of Dentistry and Oral Health,Aarhus University

Summary

このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスとストレプトコッカス・ミュータンスからなるクロスキングダムバイオフィルムの栽培を記述し、これらのバイオフィルム内の細胞外pHを監視するための共焦点顕微鏡ベースの方法を提示する。

Abstract

真菌細胞と細菌細胞の両方からなるクロスキングダムバイオフィルムは、歯内感染症、歯中炎、粘膜感染症、特に幼児期のうねりなど、さまざまな口腔疾患に関与しています。これらの条件の全てにおいて、バイオフィルムマトリックス中のpHは微生物と宿主の相互作用に影響を及ぼし、ひいては疾患進行に影響を及ぼす。本プロトコルは、カンジダ・アルビカンスおよび連鎖球菌ミュータンを含むクロスキングダムバイオフィルム内のpHダイナミクスをモニターする共焦点顕微鏡ベースの方法を記述する。pH依存性デュアルエミッションスペクトルとレシオメトリックプローブC-SNARF-4の染色特性は、バイオフィルムの細胞外領域におけるpHの低下を決定するために利用される。プローブでpHレシオメトリーを使用するには、細心の注意を払った画像パラメータの選択、染料の完全なキャリブレーション、および画像データの慎重な閾値ベースの後処理が必要です。正しく使用すれば、バイオフィルムの異なる領域における細胞外pHの迅速な評価が可能になり、時間の経過とともに水平および垂直の両方のpH勾配を監視することができます。共焦点顕微鏡の使用は、75 μm以下の薄いバイオフィルムに対するZプロファイリングを制限する一方で、pHレシオメトリーの使用は、界を越えたバイオフィルムにおける重要な毒性因子の非侵襲的研究に理想的に適している。

Introduction

真菌種および細菌種の両方を含む界を横断するバイオフィルムは、口腔内のいくつかの病理学的状態に関与している。カンディダ属は、頻繁に歯内感染症1および歯周病変2、3から単離されている。粘膜感染症において、ミツチス群由来のレンサ球菌種は、インビトロモデルおよびマウスモデル4、5、6、7の両方で真菌バイオフィルム形成、組織浸潤、および播種を増強することが示されている。最も興味深いことに、カンディダsppの経口運送は、子供8における齲虫の蔓延に関連することが証明されている。げっ歯類モデルに示すように、レンサ球菌ミュータンとカンジダスアルビカンスとの共生関係は、細胞外多糖の産生を増加させ、より厚く、より多くの齲蝕性バイオフィルム9、10の形成をもたらす。

上記のすべての条件において、特に幼児期のうねりは、疾患進行にとってバイオフィルムpHが重要であり、および、酸性マイクロ環境の開発のためのバイオフィルムマトリックスの著しい役割を有し、11は、クロスキングダムバイオフィルム内のpH変化を研究することを可能にする方法論を求めている。細菌12および真菌13のバイオフィルムの中のpHを監視するための簡単で正確な共焦点顕微鏡ベースのアプローチが開発されている。レシオメトリック色素C-SNARF-4と閾値ベースの画像後処理により、細胞外pHはバイオフィルム14の3次元すべてにおいてリアルタイムに決定することができる。バイオフィルムにおける顕微鏡ベースのpHモニタリングに関する他の公開技術と比較して、C-SNARF-4によるpHレシオメトリーは、参照色素15を含む粒子または化合物の合成または2光子励起16の使用を必要としないため、簡便かつ安価である。1つの染料を使用するだけで、プローブ区画化、蛍光ブリードスルー、選択的漂白16、17、18の問題を防ぎ、細胞内pHと細胞外pHの間で信頼性の高い差別化を可能にします。最後に、色素を用いたインキュベーションは、バイオフィルムの成長後に行われ、実験室とその場で成長したバイオフィルムの両方を研究することができます。

本研究の目的は、pHレシオメトリーの使用を拡張し、界を越えたバイオフィルムのpH変化を研究する方法を提供することである。概念実証として、この方法は、グルコースにさらされたS.ミュータンとC.アルビカンスからなる二重種バイオフィルムのpHを監視するために使用される。

Protocol

唾液採取の議定書はオーフス郡の倫理委員会(M-20100032)によって審査され承認された。 1. クロスキングダムバイオフィルムの栽培 有酸素条件下で37 °Cの血の寒天の版のS.ミュータンDSM 20523およびC.アルビカンスNCPF 3179を成長させる。 脳心臓注入(BHI)の5 mLで満たされた試験管に各生物の単一コロニーを移管する。37 °Cで好気条件下で18時間成長し?…

Representative Results

24時間と48時間後、ウェルプレートで開発された堅牢なクロスキングバイオフィルム。C.アルビカンスは様々な程度の糸状成長を示し、S.ミュータンは高さ35μmまでの密なクラスターを形成した。真菌ヒパエの周りにグループ化された単一細胞およびS.ミュータンの鎖、および大きな細胞間空間は、ボリュームマトリックスの存在を示した(図S1)。 <p class="jove_co…

Discussion

C.アルビカンスとストレプトコッカスSppを含むクロスキングダムバイオフィルムの栽培のための異なるプロトコルは、以前に説明されている9、22、23、24、25。しかし、本セットアップでは、単純な成長条件、通常の営業日と互換性のあるタイムスケジ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アネット・アクジャル・トムセンとハビエル・E・ガルシアは、優れた技術サポートを受けています。著者らは、画像解析に関する実りある議論に対するルーベンス・スピン・ネトに感謝している。

Materials

Blood agar plates Statens Serum Institut 677
Brain heart infusion Oxoid CM1135
Brain heart infusion + 5 % sucrose BDH laboratory supplies 10274
Candida albicans National Collection of Pathogenic Fungi NCPF 3179
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
daime: digital image analysis in microbial ecology Universität Wien N/A Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime
Dimethyl sulfoxide Life Technologies D12345
Fetal bovine serum Gibco Life technologies 10270
GS-6R refrigerated centrifuge Beckman N/A
ImageJ National Institutes of Health N/A Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij
Java Oracle N/A Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download
µ-Plate 96 Well Black Ibidi 89626
MyCurveFit MyAssays Ltd. N/A
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer Bioworld 700728
PHM210 pH-meter Radiometer Analytical
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective Zeiss N/A NA=1.4
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid Life Technologies S23920
Sterile physiological saline VWR 6404
Streptococcus mutans Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSM 20523
Vis-spectrophotometer V-3000PC VWR N/A
XL Incubator PeCON N/A
Zeiss LSM 510 META Zeiss N/A
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References

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Schlafer, S., Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60270, doi:10.3791/60270 (2020).
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