Мониторинг внеклеточного рН в кросс-Королевства Biofilms с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Протокол описывает выращивание кросс-царства биопленок, состоящий из Candida Albicans и Streptococcus mutans и представляет конфокальную микроскопию на основе метода для мониторинга внеклеточного рН внутри этих биопленок.
Abstract
Кросс-царство биопленки, состоящие из грибковых и бактериальных клеток участвуют в различных заболеваний полости рта, таких как эндодонтические инфекции, пародонтит, слизистой инфекции и, прежде всего, раннего детства кариеса. Во всех этих условиях рН в матрице биопленки воздействует на взаимодействие микробов-хозяина и, таким образом, прогрессирование болезни. Настоящий протокол описывает конфокальный метод на основе микроскопии для мониторинга динамики рН внутри кросс-царства биопленок, включая Candida Albicans и Streptococcus mutans. РН-зависимый спектр двойного излучения и окрашивающие свойства социеметрического зонда C-SNARF-4 используются для определения капель рН во внеклеточных областях биопленок. Использование коэффициента рН с зондом требует тщательного выбора параметров изображения, тщательной калибровки красителя и осторожной, пороговой постобработки данных изображения. При правильном использовании метод позволяет быстро оценивать внеклеточный рН в различных областях биопленки и, таким образом, мониторинг как горизонтальных, так и вертикальных градиентов рН с течением времени. В то время как использование конфокальной микроскопии ограничивает профилирование до тонких биопленок размером 75 мкм или менее, использование коэффициента рН идеально подходит для неинвазивного изучения важного фактора вирулентности в биопленках кросс-царства.
Introduction
Кросс-царство биопленки, состоящие как грибковых и бактериальных видов участвуют в нескольких патологических условиях в полости рта. Candida spp. часто были изолированы от эндодонтических инфекций1 и от пародонта поражений2,3. В слизистых инфекций, стрептококковых видов из группы мит, были показаны для повышения грибковой биопленки формирования, ткани вторжения, и распространение в обоих в пробирке и морин модели4,5,6,7. Самое интересное, устные перевозки Candida spp. было доказано, что связано с распространенностью кариеса у детей8. Как показано в моделях грызунов, симбиотические отношения между Streptococcus mutans и Candidas albicans увеличивают выработку внеклеточных полисахаридов и приводят к образованию более толстых и кариогенных биопленок9,10.
Во всех вышеупомянутых условиях, раннего детства кариеса, в частности, биопленка рН имеет важное значение для прогрессирования заболевания, и выдающаяся роль биопленки матрицы для развития ацидогенной микросреды11 требует методологии, которые позволяют изучать изменения рН внутри кросс-царства биопленки. Были разработаны простые и точные подходы на основе конфокальной микроскопии для мониторинга рН внутри бактериальных12 и грибковых13 биопленок. С соотношением метрического красителя C-SNARF-4 и пороговым изображением после обработки, внеклеточный рН может быть определен в режиме реального времени во всех трех измерениях биопленки14. По сравнению с другими опубликованными методами для микроскопии на основе рН-мониторинга в биопленках, рН коэффициентеметрия с C-SNARF-4 проста и дешева, потому что она не требует синтеза частиц или соединений, которые включают эталонный краситель15 или использование двухфотонных возбуждения16. Использование только одного красителя предотвращает проблемы с разобщенностью зонда, флуоресцентным кровотечениемчерез,и селективное отбеливание 16,17,18 в то же время позволяет надежной дифференциации между внутри- и внеклеточного рН. Наконец, инкубация красителя осуществляется после роста биопленки, что позволяет изучать как лабораторные, так и на месте выращенные биопленки.
Целью настоящей работы является расширение использования коэффициента рН и предоставление метода изучения изменений рН в биопленках кросс-царства. В качестве доказательства концепции, метод используется для мониторинга рН в биопленки двойного вида, состоящий из S. mutans и C. albicans подвергаются воздействию глюкозы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Различные протоколы для выращивания кросс-царства биопленок с участием C. Albicans и Streptococcus spp. были описаны ранее9,22,23,24,25. Тем не менее, нынешняя установка фокусируется на простых условия…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Анетт Акьяр Томсен и Хавьер Э. Гарсия признаны за отличную техническую поддержку. Авторы благодарят Рубенса Спин-Нето за плодотворные дискуссии по анализу изображений.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
