该协议描述了由念珠菌和链球菌组成的跨王国生物膜的培养,并提出了一种基于共焦点显微镜的方法,用于监测这些生物膜内的细胞外pH值。
由真菌和细菌细胞组成的跨王国生物膜涉及各种口腔疾病,如内膜感染、牙周炎、粘膜感染,以及最值得注意的是儿童早期幼细胞。在所有这些条件下,生物膜基质中的pH影响微生物-宿主相互作用,从而影响疾病进展。本协议描述了一种基于共聚焦显微镜的方法,用于监测包括念珠菌和链球菌在内的跨王国生物膜内的pH动力学。利用pH依赖双发射光谱和比例探头C-SNARF-4的染色特性,确定生物膜细胞外区域pH的下降。在探头中使用 pH 比度测量需要仔细选择成像参数、彻底校准染料以及仔细、基于阈值的图像数据后处理。正确使用后,该技术可在生物膜的不同区域快速评估细胞外 pH 值,从而监测水平和垂直 pH 梯度随时间推后。虽然共聚焦显微镜的使用将Z型探型限制在75μm或以下的薄生物膜,但pH比度测定法的使用非常适合对跨王国生物膜中一个重要的毒力因子进行非侵入性研究。
包括真菌和细菌物种的跨王国生物膜涉及口腔中的多种病理条件。念珠菌经常从内淋病感染1和牙周病变2,3分离。在粘膜感染中,米炎组链球菌物种已被证明能增强真菌生物膜的形成、组织入侵,并在体外和小鼠模型4、5、6、7中传播。最有趣的是,坎迪达spp的口服运输已被证明与儿童8的卡英的流行有关。如啮齿动物模型所示,粘膜链球菌和坎迪塔斯白化病之间的共生关系增加了细胞外多糖的产生,并导致形成更厚、更结血的生物膜9,10。
在上述所有条件下,特别是幼儿期,生物膜pH对疾病进展非常重要,生物膜基质在酸原微环境的发展中发挥突出作用11要求采用各种方法,允许研究跨王国生物膜内的pH变化。已开发出简单、准确的基于共聚焦显微镜的方法,用于监测细菌12和真菌13生物膜内的pH。通过比例染料C-SNARF-4和基于阈值的图像后处理,可以在生物膜14的所有三个维度中实时确定细胞外pH值。与生物膜中基于显微镜的pH监测技术相比,pH与C-SNARF-4的比值测量简单而便宜,因为它不需要合成颗粒或化合物,包括参考染料15或使用双光子激发16。仅使用一种染料可以防止探针条块分割、荧光透流和选择性漂白16、17、18的问题,同时仍然允许对细胞内和细胞外pH的可靠区分。最后,在生物膜生长后使用染料进行孵育,从而可以研究实验室和原位生长的生物膜。
本研究的目的是扩大pH比度测定的使用,并提供一种研究跨王国生物膜pH变化的方法。作为概念的证明,该方法用于监测暴露于葡萄糖的双种生物膜中的pH。
涉及白化病和链球菌的跨王国生物膜的培养方案,在之前已经描述了9,22,23,24,25。然而,目前的设置侧重于简单的生长条件,与正常工作日兼容的时间表,平衡的物种组成,以及开发大量的生物膜基质。此外,96孔板涂有唾液溶液,在一定程度上模拟…
The authors have nothing to disclose.
阿内特·阿克尔·汤姆森和哈维尔·加西亚因出色的技术支持而得到认可。作者感谢鲁本斯·斯宾-内托对图像分析进行了富有成果的讨论。
Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
XL Incubator | PeCON | N/A | |
Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |