رصد درجة الحموضة خارج الخلية في الأغشية الحيوية عبر المملكة باستخدام المجهر كونكوالبؤر
Summary
يصف البروتوكول زراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من المبيضات البيض وMutans العقدية ويقدم طريقة confocal المجهرية المستندة إلى رصد درجة الحموضة خارج الخلية داخل هذه الأغشية الحيوية.
Abstract
وتشارك الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتكون من كل من الخلايا الفطرية والبكتيرية في مجموعة متنوعة من أمراض الفم، مثل الالتهابات اللاقانية، والتهاب اللثة، والالتهابات المخاطية، وأبرزها تسوس الطفولة المبكرة. في كل هذه الظروف ، يؤثر درجة الحموضة في مصفوفة البيوفيلم على تفاعلات الميكروب والمضيف وبالتالي تطور المرض. ويصف البروتوكول الحالي طريقة مُحدّدة للتنظير المجهري لرصد ديناميات درجة الحموضة داخل الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تتألف من المبيضات البيضوات وموتان المكورات العقدية. يتم استغلال الطيف ثنائي الانبعاثات المعتمد على درجة الحموضة وخصائص تلطيخ المسبار النسبةي C-SNARF-4 لتحديد القطرات في درجة الحموضة في المناطق خارج الخلية من الأغشية الحيوية. يتطلب استخدام قياس نسبة الأس الهيدروجيني مع المسبار اختيارًا دقيقًا لمعلمات التصوير ، ومعايرة شاملة للصبغة ، ومعالجة دقيقة تستند إلى العتبة بعد معالجة بيانات الصورة. عندما تستخدم بشكل صحيح، تسمح هذه التقنية للتقييم السريع للدرجة الحموضة خارج الخلية في مناطق مختلفة من بيوفيلم وبالتالي رصد كل من التدرجات درجة الحموضة الأفقية والعمودية مع مرور الوقت. في حين أن استخدام المجهر التكوري يحد من Z-profiling إلى أغشية حيوية رقيقة تبلغ 75 ميكرومتر أو أقل ، فإن استخدام قياس نسبة الحموضة مناسب بشكل مثالي للدراسة غير الباضعة لعامل الفوعة الهام في الأغشية الحيوية عبر المملكة.
Introduction
تشارك الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تضم كلا من الأنواع الفطرية والبكتيرية في العديد من الحالات المرضية في تجويف الفم. المبيضات spp. وكثيرا ما تم عزلها من الالتهابات اللاقانية1 ومن آفات اللثة2،3. في الالتهابات المخاطية ، ثبت أن الأنواع العقدية من مجموعة التهاب الخلايا العضوية تعزز تكوين البيوفيلم الفطري ، وغزو الأنسجة ، والنشر في كل من نماذج المختبر والمورين4،5،6،7. الأكثر إثارة للاهتمام، وقد ثبت النقل عن طريق الفم من المبيضات spp. أن تكون مرتبطة مع انتشار التسوس في الأطفال8. كما هو مبين في نماذج القوارض ، فإن العلاقة التكافلية بين الموكانات العقدية والمبيضات البيض تزيد من إنتاج السكريات خارج الخلية وتؤدي إلى تكوين أفلام حيوية أكثر سمكًا وأكثر مسرطنة9،10.
في جميع الظروف المذكورة أعلاه ، تسوس الطفولة المبكرة على وجه الخصوص ، فإن درجة الحموضة في بيوفيلم ذات أهمية لتطور المرض ، والدور البارز لمصفوفة الأغشية الحيوية لتطوير البيئات الدقيقة الحمضية11 يدعو إلى منهجيات تسمح بدراسة تغيرات درجة الحموضة داخل الأغشية الحيوية عبر المملكة. وقد وضعت بسيطة ودقيقة النهج القائمة على المجهر confocal لرصد درجة الحموضة داخل البكتيريا12 والفطرية13 الأغشية الحيوية. مع صبغة النسبة C-SNARF-4 والصورة المستندة إلى العتبة بعد المعالجة ، يمكن تحديد درجة الحموضة خارج الخلية في الوقت الحقيقي في جميع الأبعاد الثلاثة للبيوفيلم14. بالمقارنة مع غيرها من التقنيات المنشورة لرصد درجة الحموضة المستندة إلى المجهر في الأغشية الحيوية ، فإن قياس نسبة الحموضة مع C-SNARF-4 بسيط ورخيص ، لأنه لا يتطلب تركيب الجسيمات أو المركبات التي تتضمن صبغة مرجعية15 أو استخدام الإثارة ذات الفوتونين 16. استخدام صبغة واحدة فقط يمنع مشاكل مع تقسيم التحقيق، الفلورسنت تنزف من خلال، والتبييض الانتقائي16،17،18 في حين لا يزال يسمح للتمييز موثوق بها بين داخل وخارج الخلية درجة الحموضة. وأخيرا، يتم تنفيذ الحضانة مع الصبغة بعد نمو بيوفيلم، والذي يسمح بدراسة كل من المختبر وفي الأغشية الحيوية المزروعة في الموقع.
والهدف من هذا العمل هو توسيع نطاق استخدام قياس نسب الحموضة وتوفير طريقة لدراسة تغيرات درجة الحموضة في الأغشية الحيوية عبر المملكة. كدليل على المفهوم ، يتم استخدام الطريقة لمراقبة درجة الحموضة في الأنواع الحيوية المزدوجة التي تتكون من S. mutans وC. albicans المعرضة للجلوكوز.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكولات مختلفة لزراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة التي تنطوي على C. albicans وStreptococcus spp. ومع ذلك ، يركز الإعداد الحالي على ظروف النمو البسيطة ، وجدول زمني متوافق مع أيام العمل العادية ، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ومن المسلم به أنيت Aakjær تومسن وخافيير غارسيا لدعم فني ممتاز. يشكر المؤلفون روبنز سبين نيتو على المناقشات المثمرة حول تحليل الصور.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
References
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
