Burada fare modellerinde kan monositlerinin kemotaktik aktivitesini ölçmek, beslenme, farmakolojik ve genetik müdahalelerin kan monositi üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve kan monositlerinden elde edilen makrofajları karakterize etmek için bir protokol sıyoruz. monosit-kemoattractant protein-1 (MCP-1) yüklü bazal membran kaynaklı jel fişleri kullanarak fare modelleri.
Doku homeostazis ve onarım kritik monosit kaynaklı makrofajlar işe bağlıdır. Monosit kaynaklı makrofajların hem yetersiz hem de aşırı işe alınması yara iyileşmesini bozabilir. Biz yüksek yağ ve yüksek şeker diyetler monosit priming ve disfonksiyon teşvik gösterdi, hiper kemotaktik fenotip içine sağlıklı kan monositleri dönüştürme disregulated aktivasyon profilleri ve bozulmuş fenotipik ile makrofajlar ayırt etmeye hazır Plastisite. Monosit kaynaklı makrofajların aşırı işe alınması ve disregulated aktivasyon profilleri ile makrofajların işe alınmasının metabolik bozukluklarla ilişkili kronik inflamatuar hastalıkların gelişimine önemli bir katkıda bulunmuştur. ateroskleroz ve obezite de dahil olmak üzere. Bu protokolün amacı, monosit astar ve disfonksiyon için bir biyomarker olarak kan monositlerinin kemotaktik aktivitesini ölçmek ve makrofaj fenotip kan monositlerini karakterize etmek tir. Tek hücreli Batı leke analizi ni kullanarak, farelere enjekte edilen MCP-1 yüklü bazal membran kaynaklı jel fişlerine alınan hücrelerin %24 saat 33’ünün monosit ve makrofaj lar olduğunu; 3. günden sonra %58. Ancak 5. günde monosit ve makrofaj sayılarında anlamlı olarak azalmıştır. Son olarak, bu tahliller aynı zamanda cerrahi olarak alınan bazal membran türetilmiş jel fişlerden canlı makrofajların izolasyonuna olanak sağladığını gösteriyoruz, bu da tek hücreli Batı leke analizi ile sonraki karakterizasyona tabi tutulabilir.
Monosit kaynaklı makrofajların işe alınması, ateroskleroz ve obezite1,2,3, metabolik bozukluklar ile ilişkili kronik inflamatuar hastalıkların gelişimi için gereklidir, 4 . Doku yaralanması bölgelerinde monosit kaynaklı makrofajların sayısı ve plastisite doku homeostaz ve onarım için önemlidir. Monosit kaynaklı makrofajların hem altında hem de aşırıişe alınması yara iyileşmesini bozabilir 5. Yerel doku iltihabı tetikleyen, örneğin, birikimi ve oksidasyonu ile düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) aort duvarında veya yağ asitleri veya bakteriyel lipopolisakkarit tarafından adipositinflamatuar aktivasyonu bağırsak yoluyla sızıntı monosit kemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) gibi kemokinler de dahil olmak üzere inflamatuar mediatörlerin salınımına yol açar. MCP-1 C-C kemokin ailesinin bir üyesi ve doku iltihabı ve yaralanma sitelerine monosit kaynaklı makrofajların işe sorumlu önemli bir kemoattractant6,7,8, 9,10. Vasküler endotel inflamatuar aktivasyonu, hücreler arası yapışıklık molekülü 1 (ICAM-1) ve vasküler hücre adezyon molekülü 1 (VCAM-1)11,12gibi yapışıklık moleküllerinin ekspresyonuna neden olur, boyunca rulo MCP-1 tarafından aktive monositler dolaşan, sıkıca uymak ve daha sonra subendothelial uzaya transmigration12. İnfiltrasyon monositler makrofajlar içine ayırt, hangi bir proinflamatuar fenotip içine aktive edilebilir, akut inflamatuar süreci sürüş. Mikroçevre tarafından yönlendirilen pro-inflamatuar makrofajlar, inflamatuar hücrelerin temizlenmesinde, pro-inflamatuar sinyallerin çıkarılmasında ve doku onarımı ve yaranın tamamlanmasında kritik rol oynayan inflamasyon çözümlü makrofajlara dönüşebilir. şifa12,13.
Kronik metabolik stres kemo-çekici ve artan monosit işe dramatik gelişmiş duyarlılık için monositler asal, ve biz astarlı monositded disregulated aktivasyon programları ve polarizasyon ile makrofajlar neden olduğunu gösterdi devletler14,15,16. Monosit priming ateroskleroz teşvik, obezite, ve muhtemelen diğer kronik inflamatuar hastalıklar steatohepatit gibi metabolik bozukluklar ile ilişkili, böbrek hastalıkları ve muhtemelen kanser. İnsan hastalıklarının fare modellerinde monosit astarını değerlendirmek ve ölçmek için, in vivo14,15,16′daki kemotaktik aktiviteyi ölçerek kan monositlerinin astar durumunu değerlendirmek için yeni bir teknikgeliştirdik. 17. yıl. Yaklaşımımız ya bir kemoattractant yüklü bodrum membran türetilmiş jel enjeksiyonu içerir – biz yaygın OLARAK MCP-1 kullanın – ya da araç sol ve sağ kanadı içine, sırasıyla, farelerin. Subkutan olarak dikkatlice enjekte edildiğinde, bodrum zarından elde edilen jel, kemokinlerin yayıldığı ve çevrenin metabolik veya inflamatuar durumundan etkilenmeyen tanımlanmış bir kemotaktik gradyan oluşturabileceği tek bir fiş oluşturacaktır. doku veya alıcı fare.
Bizim çalışma için kullandığımız bazal membran türetilmiş jel Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomu, bu tür ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri açısından zengin bir tümör çıkarılan bir çözünürbazbaz membran hazırlık. Bu kompleks protein karışımı laminin (%60), kollajen IV (%30), köprü molekülü entaktinini (%8) ve bir dizi büyüme faktörünü içerir. Bazal membran matris fiş tonu başlangıçta çeşitli büyüme faktörleri 18yanıt olarak anjiyogenez araştırmak için geliştirilmiştir,19. Ancak, monosit kemotaksis çalışma için, endotel hücre alımı ve anjiyogenez en aza indirmek için büyüme faktörü tükenmiş bazal membran kaynaklı jel kullanmak önemlidir. Matrigel’i (bundan böyle bazal membrandan elde edilen jel olarak anılacaktır) benzersiz ve özellikle yararlı kılan şey, 10 °C’nin altındaki sıcaklıklarda sıvılaşması ve kemokinlerin erimesine izin verilmesidir. 22 °C’nin üzerindeki sıcaklıklarda, bazal membrandan elde edilen çözelti hızla faz geçişinden geçer ve hızla bir hidrojel oluşturur. Fişler cerrahi olarak çıkarılabilir, temizlenebilir ve tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için bacillus kaynaklı nötr metalloprotaz ile çözülebilir, bu da rnaseq, tek hücreli RNA ve çeşitli diğer floresan aktive hücre ayırıcısı (FACS) üzerinde analiz edilebilir. omics teknikleri. Burada, enjeksiyondan bir, üç veya beş gün sonra, bodrum zarından elde edilen jel takılır içine işe hücre popülasyonlarının karakterizasyonu için tek hücreli Batı leke analizi nin kullanımını açıklıyoruz.
İn vivo kemotaksis titreci geliştirdik, bazal membrandan elde edilen matrisin eşsiz fiziksel özelliklerinden ve bu eşsiz matrisi kemokinlerle yükleyip farelere enjekte etme yeteneğinden yararlanarak. Tsa bize mcp-1 için burada gösterildiği gibi, monositler (ve makrofajlar) monositlerin duyarlılık ve monosit üzerinde ya genetik manipülasyon veya farmakolojik, diyet ve diğer çevresel maruz ilerletme etkilerini canlı farelerde değerlendirmek için izin verir kemotaksis. Çünkü bu farelerde oluşturduğumuz kemokin gradyan aslında genetik, farmakolojik, diyet ya da çevresel maruziyetten etkilenmez, monosit kemotaktik aktivitesindeki değişiklikler aslında bu monositlerde fonksiyonel değişiklikleri yansıtır ve gösterdiğimiz gibi daha önce, aynı zamanda protein ve transkripsiyonel düzeyde hem de yeniden programlama17,20. Farelerdeki metabolik stresin kemotorete monosit duyarlılığını artırdığını ve bu hiper-kemotaktik aktivitenin artmış protein S-glutatyonilasyon, geri dönüşümlü, redoks bağımlı posttranslational ile ilişkili olduğunu bildirdik. protein modifikasyonu, çoğu durumda enzimatik ve protein fonksiyonu kaybına yol açar21,22, ve bazı durumlarda bile protein bozulması teşvik16,23.
Bu prosedürü başarıyla uygulamak ve bu tahkikat ile en iyi sonuçları elde etmek için, tekil bir iyi biçimlendirilmiş fiş oluşturmak için doğru hacimleri bodrum membrantif türetilmiş çözelti yavaş yavaş enjekte edilmesi ve fibröz kapsüller kaldırılması önemlidir tamamen hasat bodrum membran kaynaklı jel fişleri temiz fişler almak için, dispase çözeltisi tüm fişin çözülmesini kolaylaştırır. Verilerimiz, fişi hayvanlarda üç gün boyunca bırakmanın 1) sinyal yoğunluğunu, yani her fişe alınan monosit ve makrofaj ların sayısını, 2) sinyalin seçiciliğini, yani içindeki monosit ve makrofajların içeriğini optimize ettiğini göstermektedir. toplam hücre popülasyonları ve 3) sinyalin özgüllüğü, yani mcp-1’e yanıt olarak monosit ve makrofajların artması araca göre. Son olarak, bodrum membrantöyonu türetilmiş jel fişi ile birlikte son teknoloji tek hücre bazlı yaklaşımların fişlere alınan monositleri karakterize etmek ve böylece potansiyel fenotipin bir anlık görüntüsünü elde etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. monosit kaynaklı makrofajlar belirli genetik, farmakolojik, diyet veya çevresel müdahalelere yanıt olarak herhangi bir fare modelinde yaralanma sitelerine işe alınıyor.
Dikkate alınması gereken tsay sınırlamaları vardır. İlk olarak, anestezi, bazal membrandan elde edilen çözelti enjeksiyonu ve cerrahi diseksiyon dahil olmak üzere fare kullanımı, tek fişler ve tekrarlanabilir veriler oluşturmak için pratik gerektirir. İkinci olarak, MCP-1 yüklü fişler içine işe en hücreleri monositler ve makrofajlar iken, önemli bir sayı değildir. Bu, bu hücre popülasyonu üzerinde yapılan diğer, tek hücreli olmayan analitik tahlillerin yorumlanmasını etkileyebilir. Son olarak, scWB için hücre lisis koşulları hafif olduğundan, proteinlerin göç mesafeleri standart WB’den farklı olabilir ve protein büyüklüğü ile ilişkili olmayabilir. Bu nedenle, her hücre lisis ve çalışma süreleri test edilmesi ve kullanılan her birincil antikor için doğrulanması gerekir.
The authors have nothing to disclose.
Bu proje NIH’den (AT006885) R.A.’ya yapılan bağışlarla desteklenmiştir.
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |