Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar a atividade Quimiotáticos de monócitos do sangue em modelos do rato, para avaliar os efeitos de intervenções nutritivas, farmacológicas e genéticas no monocyte do sangue e para caracterizar os macrófagos derivados do sangue dos monócitos em modelos de mouse usando o monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-carregado porão membrana-derivado gel plugs.
A homeostase tecidual e a reparação são criticamente dependentes do recrutamento de macrófagos derivados de monócitos. O recrutamento de macrófagos derivados de monócitos pode prejudicar a cicatrização de feridas. Nós mostramos que as dietas elevadas gordas e elevadas do açúcar promovem o priming e a deficiência orgânica do monocyte, convertendo monócitos saudáveis do sangue em um phenotype Quimiotáticos Hyper preparado para diferenciar-se nos macrófagos com perfis disregulados da ativação e o fenotípico prejudicado Plasticidade. Acredita-se que o excesso de recrutamento de macrófagos derivados de monócitos e o recrutamento de macrófagos com perfis de ativação disregulados sejam um dos principais contribuintes para o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas associadas a distúrbios metabólicos, incluindo aterosclerose e obesidade. O objetivo deste protocolo é quantificar a atividade quimiotática de monócitos sanguíneos como um biomarcador para a escorva e disfunção de monócitos e para caracterizar os monócitos de sangue do fenótipo de macrófago estão prestes a se diferenciar nesses modelos de camundongo. Usando a análise ocidental do borrão da única pilha, nós mostramos que após 24 h 33% das pilhas recrutadas em plugues de gel membrana-derivados do porão MCP-1-Loaded injetados em ratos são monócitos e macrófagos; 58% após o dia 3. No entanto, no 5º dia, os números de monócitos e macrófago foram significativamente reduzidos. Finalmente, nós mostramos que estes ensaios igualmente permitem a isolação de macrófagos vivos dos plugues membrana-derivados cirurgicamente recuperados do gel do porão, que podem então ser sujeitados à caracterização subseqüente pela única análise ocidental do borrão da pilha.
O recrutamento de macrófagos derivados de monócitos é essencial para o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas associadas a distúrbios metabólicos, incluindo a aterosclerose e a obesidade1,2,3, a 4. O número de macrófagos derivados de monócitos em sítios de lesão tecidual, bem como sua plasticidade, são críticos para a homeostase tecidual e reparo. Tanto o recrutamento e excesso de macrófagos derivados de monócitos pode prejudicar a cicatrização de feridas5. Desencadeando a inflamação tecidual local, por exemplo, pela acumulação e oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) na parede aórtica ou ativação inflamatória de adipócitos por ácidos graxos ou lipopolissacarídeos bacterianos vazando através do intestino barreira, conduz à liberação de mediadores inflamatórios, incluindo quimiocinas tais como a proteína-1 do chemoattractant do monocyte (MCP-1/CCL2). O MCP-1 é um membro da família c-c quimiocina e um quimioatractivo chave responsável pelo recrutamento de macrófagos derivados de monócitos para sítios de inflamação e lesão tecidual6,7,8, 9,10. A ativação inflamatória do endotélio vascular resulta na expressão de moléculas de aderências como molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1) e molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1)11,12, permitindo monócitos circulantes ativados pelo MCP-1 para rolar ao longo, aderir firmemente e posteriormente transmigrar para o espaço subendotelial12. Os monócitos infiltrantes se diferenciam em macrófagos, que podem ser ativados em um fenótipo pró-inflamatório, conduzindo o processo inflamatório agudo. Impulsionada pelo microambiente, os macrófagos pró-inflamatórios podem se converter em macrófagos que resolvam a inflamação, que desempenham papéis críticos no esclarecimento de células inflamatórias, removendo sinais pró-inflamatórios e completando o reparo tecidual e a ferida cura12,13.
O stress metabólico crônico primos monócitos para a resposta dramàtica aumentada aos Chemo-attractants e o recrutamento aumentado do monocyte, e nós mostramos que os monócitos aprontados dão a ascensão aos macrófagos com programas e polarização dysregulamentada da ativação Estados14,15,16. A escorva do monocyte promove a aterosclerose, a obesidade, e possivelmente outras doenças inflamatórios crônicas associadas com as desordens metabólicas tais como o Steatohepatitis, as doenças renais e possivelmente o cancro. Para avaliar e quantificar a escorva de monócitos em modelos de camundongo de doenças humanas, desenvolvemos uma nova técnica para avaliar o estado de escorva de monócitos sanguíneos medindo a atividade quimiotática in vivo14,15,16, a 17. Nossa aproximação envolve a injeção do gel membrana-derivado do porão carregado com o um chemoattractant-nós usamos geralmente o MCP-1-ou o veículo no flanco esquerdo e direito, respectivamente, dos ratos. Quando cuidadosamente injetado por via subcutânea, o gel derivado da membrana basal irá formar um único plugue, a partir do qual as quimiocinas podem difundir e criar um gradiente quimiotático definido que não é afetado pelo Estado metabólico ou inflamatório do entorno tecido ou o rato destinatário.
O gel derivado da membrana basal que utilizamos para o nosso ensaio é uma preparação de membrana basal solubilizada extraída do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), um tumor rico em proteínas de matriz extracelular (ECM). Esta mistura complexa de proteínas contém laminina (60%), colágeno IV (30%), a molécula de ponte entactina (8%), e uma série de fatores de crescimento. O ensaio do plugue da matriz da membrana do porão foi desenvolvido originalmente para investigar a angiogênese em resposta a vários fatores de crescimento18,19. Entretanto, a fim estudar o chemotaxis do monocyte, é importante usar o gel membrana-derivado do porão do fator de crescimento-esgotado para minimizar o recrutamento e a angiogênese endothelial da pilha. O que torna o Matrigel (referido como gel derivado da membrana do porão doravante) único e particularmente útil é que a temperaturas inferiores a 10 ° c liquefaz, permitindo que as quimiocinas sejam dissolvidas. Em temperaturas acima de 22 ° c, a solução derivada da membrana basal passa rapidamente por uma transição de fase e forma rapidamente um hidrogel. As fichas podem ser excisadas cirurgicamente, limpas e dissolvidas com um metaloprotease neutro derivado de bacilo para produzir suspensões de células únicas, que podem ser analisadas em um classificador de células ativados por fluorescência (FACS), por RNAseq, RNA de célula única e uma variedade de outros técnicas de Ômicas. Aqui nós descrevemos o uso da análise ocidental do borrão da único-pilha para a caracterização das populações da pilha recrutadas nos plugues membrana-derivados do gel do porão um, três ou cinco dias após a injeção.
Desenvolvemos um ensaio de quimiotaxia in vivo, fazendo uso das propriedades físicas únicas da matriz derivada da membrana basal e da capacidade de carregar esta matriz única com quimiocinas e injetá-la em camundongos. O ensaio permite avaliar em camundongos vivos a responsividade dos monócitos (e macrófagos) às quimiocinas, como ilustrado aqui para o MCP-1, e os efeitos da manipulação genética ou da exposição farmacológica, dietética e outras exposições ambientais sobre monócitos Chemotaxis. Como o gradiente de quimiocina que criamos nesses camundongos é essencialmente afetado pela exposição genética, farmacológica, dietética ou ambiental, as alterações na atividade quimiotática de monócitos refletem, na verdade, mudanças funcionais nesses monócitos e, como mostramos anteriormente, também a reprogramação tanto na proteína quanto no nível transcricional17,20. Nós relatado que o stress metabólico nos ratos aumenta a compreensibilidade do monocyte ao chemoattractant e que esta atividade Hyper-chemotactic se correlaciona com a proteína S-glutathionylation aumentada, um redox-dependente pós-translational reversível a modificação protéica, que na maioria dos casos leva à perda da função enzimática e protéica21,22, e em algumas situações até promove a degradação protéica16,17.
Para executar com sucesso este procedimento e para obter resultados óptimos com este ensaio é crítico que os volumes exatos de solução membrana-derivada do porão estão injetados lentamente para criar um plugue bem formado singular e as cápsulas fibrosas devem ser removidas completamente para começ plugues limpos quando os plugues de gel membrana-derivados do porão da colheita, facilitam a dissolução do plugue inteiro na solução do Dispase. Nossos dados mostram que deixar a ficha nos animais por três dias otimiza 1) a intensidade do sinal, ou seja, o número de monócitos e macrófagos recrutados em cada plugue, 2) a seletividade do sinal, ou seja, o conteúdo de monócitos e macrófagos dentro do populações de células totais e 3) a especificidade do sinal, ou seja, o aumento de monócitos e macrófagos em resposta ao MCP-1 em comparação com o veículo. Finalmente, Nós demonstramos como as únicas abordagens baseadas em células de última geração em conjunto com o ensaio de plugue de gel derivado da membrana basal podem ser usadas para caracterizar os monócitos recrutados nos plugues e, assim, obter um instantâneo do fenótipo potencial de os macrófagos derivados de monócitos sendo recrutados para sítios de lesão em qualquer modelo de camundongo em resposta a intervenções genéticas, farmacológicas, dietéticas ou ambientais específicas.
Há uma série de limitações do ensaio a ser considerado. Primeiramente, a manipulação do rato, incluindo a anestesia, a injeção da solução membrana-derivada do porão, e a dissecção cirúrgica exigem a prática gerar únicos plugues e dados reprodutíveis. Em segundo lugar, enquanto a maioria das células recrutadas para o MCP-1 carregado plugues são monócitos e macrófagos, um número substancial não são. Isso pode afetar a interpretação de outros ensaios analíticos baseados em células não-únicas realizados nesta população celular. Finalmente, desde que as condições da lise da pilha para scWB são suaves, as distâncias da migração das proteínas podem diferir do WB padrão e não podem correlacionar com tamanho da proteína. Conseqüentemente, o lysis da pilha e os tempos de funcionamento têm que ser validados para que cada proteína nova seja testada e cada anticorpo preliminar usado.
The authors have nothing to disclose.
Este projeto foi apoiado por subsídios para a HNI (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |