Hier presenteren we een protocol om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten in muizen modellen te kwantificeren, om de effecten van nutritionele, farmacologische en genetische interventies op bloed monocyten te beoordelen en om de in het bloed geafgeleide macrofagen te karakteriseren in Muismodellen met behulp van monocyte-chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1)-geladen in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers.
Weefselhomeostase en reparatie zijn kritisch afhankelijk van de werving van monoyte-afgeleide macrofagen. Zowel de onder-als de overrekrutering van monoyte-afgeleide macrofagen kan de wondgenezing aantasten. We toonden aan dat hoge vetten en hoge suiker diëten monocyt priming en dysfunctie bevorderen, waardoor gezonde bloed monocyten in een Hyper chemotactisch fenotype worden omgezet om te differentiëren in macrofagen met disgereguleerde activerings profielen en verminderde fenotypische Plasticiteit. De overmatige rekrutering van monoyte-afgeleide macrofagen en rekrutering van macrofagen met disgereguleerde activerings profielen wordt verondersteld een belangrijke bijdrage te leveren aan de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten die gepaard gaan met metabole stoornissen, met inbegrip van atherosclerose en obesitas. Het doel van dit protocol is om de Chemotactische activiteit van bloed monocyten te kwantificeren als een biomarker voor monocyt priming en dysfunctie en om het macrofaag fenotype bloed monocyten te karakteriseren, zijn klaar om te differentiëren in deze Muismodellen. Met behulp van single cell Western Blot-analyse laten we zien dat 33% van de cellen die zijn gerekruteerd in MCP-1-geladen in kelder membraan-afgeleide gelpluggen die in muizen zijn geïnjecteerd, monocyten en macrofagen zijn; 58% na dag 3. Op dag 5 werden monocyt en macrofaag getallen echter significant verlaagd. Tot slot tonen we aan dat deze assays ook de isolatie van levende macrofagen van de chirurgisch opgehaalde, in het membraan afgeleide gelpluggen mogelijk maken, die vervolgens kunnen worden onderworpen aan een daaropvolgende karakterisatie door een single cell Western Blot-analyse.
De werving van monoyte-afgeleide macrofagen is essentieel voor de ontwikkeling van chronische ontstekingsziekten geassocieerd met metabole stoornissen, waaronder atherosclerose en obesitas1,2,3, 4. Het aantal monoyte-afgeleide macrofagen op plaatsen van weefsel letsel, alsmede hun plasticiteit zijn essentieel voor het weefselhomeostase en reparatie. Zowel de onder-als de overrekrutering van monoyte-afgeleide macrofagen kan de wondgenezing aantasten5. Triggering lokale weefsel ontsteking, bijvoorbeeld door de accumulatie en oxidatie van low-density lipoproteïne (LDL) in de aorta muur of inflammatoire activering van adipocytes door vetzuren of bacteriële lipopolysaccharide lekken door de intestinale barrière, leidt tot het vrijkomen van ontstekingsmediatoren, met inbegrip van chemokines zoals monocyt chemoaantretant proteïne-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 is een lid van de c-c Chemokine familie en een belangrijke chemoaantretant die verantwoordelijk is voor de werving van monoyte-afgeleide macrofagen aan plaatsen van weefsel ontsteking en-letsel6,7,8, 9,10. Inflammatoire activering van vasculaire endotheel resulteert in de uitdrukking van verklevingen moleculen zoals intercellulaire adhesie molecuul 1 (ICAM-1) en vasculaire cel adhesie molecuul 1 (VCam-1)11,12, waardoor circulerende monocyten geactiveerd door MCP-1 om mee te rollen, stevig vasthouden aan en vervolgens transmigreren in de subendotheliale ruimte12. Infiltreren monocyten differentiëren in macrofagen, die kunnen worden geactiveerd in een proinflammatoire fenotype, het stimuleren van het acute ontstekingsproces. Gedreven door de micro-omgeving, pro-inflammatoire macrofagen kunnen omzetten in ontsteking-oplossen van macrofagen, die spelen kritieke rollen in de clearing van inflammatoire cellen, pro-inflammatoire signalen te verwijderen en het voltooien van weefsel reparatie en wond genezing van12,13.
Chronische metabole stress priemgetallen monocyten voor een dramatisch verbeterde responsiviteit op chemo-loktanten en verhoogde monocyt rekrutering, en we toonden aan dat klaar monocyten aanleiding geven tot macrofagen met disgereguleerde activerings Programma’s en polarisatie Staten14,15,16. Monocyte priming bevordert atherosclerose, obesitas, en eventueel andere chronische ontstekingsziekten geassocieerd met metabole aandoeningen zoals Steatohepatitis, nierziekten en mogelijk kanker. Om monocyten te beoordelen en te kwantificeren in muizen modellen van menselijke ziekten, ontwikkelden we een nieuwe techniek om de priming-toestand van bloed monobytes te beoordelen door het meten van de Chemotactische activiteit in vivo14,15,16, 17. Onze aanpak omvat de injectie van in de kelder afgeleide gel geladen met ofwel een chemoaantretant — we gebruiken vaak MCP-1 — of voertuig in de linker-en rechterflank, respectievelijk, van muizen. Wanneer voorzichtig subcutaan geïnjecteerd, de kelder membraan-afgeleide gel zal een enkele stekker, waaruit de chemokines kunnen diffuus en creëren een gedefinieerde Chemotactische gradiënt die niet wordt beïnvloed door de metabole of inflammatoire toestand van de omringende het weefsel of de muis van de ontvanger.
De in de kelder afgeleide gel die we gebruiken voor onze assay is een ontbindend kelder membraan voorbereiding geëxtraheerd uit de engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis Sarcoom, een tumor die rijk is aan dergelijke extracellulaire matrix (ECM) eiwitten. Dit complexe eiwitmengsel bevat laminine (60%), collageen IV (30%), het overbruggings molecuul entactin (8%), en een aantal groeifactoren. De kelder membraan matrix plug assay werd oorspronkelijk ontwikkeld om angiogenese te onderzoeken in reactie op verschillende groeifactoren18,19. Echter, met het oog op de studie van monocyt chemotaxis, het is belangrijk om te gebruiken groeifactor-uitgeput kelder membraan-afgeleide gel te minimaliseren endotheliale cel werving en angiogenese. Wat Matrigel (aangeduid als “kelder-membraan-afgeleide gel voortaan”) uniek en vooral nuttig maakt, is dat bij temperaturen onder de 10 °C het vloeibaar wordt, waardoor chemokinen kunnen worden opgelost. Bij temperaturen boven 22 °C ondergaat de in de kelder afkomstige membraan oplossing snel een faseovergang en vormt deze snel een hydrogel. De stekkers kunnen chirurgisch worden uitgesneden, gereinigd en opgelost met een door Bacillus afgeleide neutrale Metalloprotease voor het opleveren van suspensies van één cel, die kunnen worden geanalyseerd op een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS), door RNAseq, eencellig RNA en een verscheidenheid aan andere omics-technieken. Hier beschrijven we het gebruik van single-cell Western Blot analyse voor de karakterisering van de celpopulaties gerekruteerd in de kelder membraan-afgeleide gel stekkers één, drie of vijf dagen na injectie.
We ontwikkelden een in vivo chemotaxis test, die gebruik maakt van de unieke fysische eigenschappen van de in de kelder verkregen membraan-afgeleide matrix en de mogelijkheid om deze unieke matrix te laden met chemokines en deze in muizen te injecteren. De bepaling stelt ons in staat om in levende muizen de responsiviteit van monocyten (en macrofagen) aan chemokines te beoordelen, zoals hier geïllustreerd voor MCP-1, en de effecten van genetische manipulatie of farmacologische, dieet-en andere milieu blootstellingen op monocyt chemotaxis. Omdat de Chemokine gradiënt die we in deze muizen creëren in essentie niet beïnvloed wordt door genetische, farmacologische, dieet-of milieublootstelling, reflecteren veranderingen in monocyt Chemotactische activiteit feitelijk functionele veranderingen in deze monocyten en, zoals we toonden eerder, ook de herprogrammering op zowel het eiwit en transcriptionele niveau17,20. We rapporteerden dat metabole stress bij muizen de responsiviteit van monocyt op chemoaantretant verhoogt en dat deze Hyper-Chemotactische activiteit correleert met verhoogde proteïne S-glutathionylatie, een reversibele, redox-afhankelijke posttranslationele eiwit modificatie, die in de meeste gevallen leidt tot verlies van enzymatische en eiwit functie21,22, en in sommige gevallen zelfs bevordert eiwitafbraak16,23.
Om deze procedure met succes uit te voeren en om optimale resultaten met deze assay te verkrijgen, is het van cruciaal belang dat nauwkeurige volumes van de in de kelder afkomstige membraan-afgeleide oplossing langzaam worden geïnjecteerd om een enkelvoudig goed gevormde plug te maken en vezelachtige capsules moeten worden verwijderd volledig te krijgen schone stekkers wanneer oogst kelder membraan-afgeleide gel stekkers, vergemakkelijkt de ontbinding van de hele plug in de dispase oplossing. Onze gegevens tonen aan dat het verlaten van de stekker in de dieren gedurende drie dagen optimaliseert 1) de signaalintensiteit, d.w.z. het aantal monocyten en macrofagen dat in elke stekker wordt gerekruteerd, 2) de selectiviteit van het signaal, d.w.z. het gehalte aan monocyten en macrofagen binnen de totale celpopulaties en 3) de specificiteit van het signaal, d.w.z. de toename van monocyten en macrofagen in reactie op MCP-1 in vergelijking met voertuig. Tot slot tonen we aan hoe State-of-the-art eencellige benaderingen in combinatie met de in de kelder afgeleide gel-plug assay kunnen worden gebruikt om de monocyten die in de stekkers worden gerekruteerd, te karakteriseren en zo een momentopname te verkrijgen van het mogelijke fenotype van de monoyte-afgeleide macrofagen die worden gerekruteerd op plaatsen van letsel in een bepaald muismodel als reactie op specifieke genetische, farmacologische, dieet-of milieu interventies.
Er zijn een aantal beperkingen van de bepaling die in aanmerking moeten worden genomen. Eerste, muis behandeling, met inbegrip van anesthesie, injectie van de kelder membraan-afgeleide oplossing, en chirurgische dissectie vereist praktijk om single stekkers en reproduceerbare gegevens te genereren. Ten tweede, terwijl de meeste cellen die worden gerekruteerd in de MCP-1 geladen stekkers monocyten en macrofagen zijn, is een substantieel aantal niet. Dit kan invloed hebben op de interpretatie van andere, niet-eencellige analytische assays uitgevoerd op deze celpopulatie. Tot slot, omdat de celllysiscondities voor scWB mild zijn, kunnen migratie afstanden van eiwitten afwijken van standaard WB en kunnen ze niet correleren met de eiwit grootte. Daarom moeten zowel de cellyse als de looptijden worden gevalideerd voor elk nieuw te testen eiwit en elk primair antilichaam dat wordt gebruikt.
The authors have nothing to disclose.
Dit project werd gesteund door subsidies aan R.A. uit de NIH (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |