Qui presentiamo un protocollo per quantificare l’attività chemiotattica dei monociti del sangue nei modelli murini, per valutare gli effetti degli interventi nutrizionali, farmacologici e genetici sul monocito del sangue e per caratterizzare i monociti del sangue derivati dai macrofagi in modelli murini che utilizzano tappi di gel derivati dalla membrana del basato monocite-chemoattractant-1 (MCP-1).
L’omeostasi dei tessuti e la riparazione dipendono in modo critico dall’assunzione di macrofagi derivati da monociti. Sia il sotto- che l’esapico dei macrofagi derivati da monociti possono compromettere la guarigione delle ferite. Abbiamo dimostrato che le diete ad alto contenuto di grassi e ad alto contenuto di zucchero promuovono l’innesco e la disfunzione monociti, convertendo monociti del sangue sani in un fenotipo iperchimico pronto a differenziarsi in macrofagi con profili di attivazione disregolati e fenotipici alterati plasticità. Si ritiene che l’eccessivo reclutamento di macrofagi derivati da monociti e il reclutamento di macrofagi con profili di attivazione disregolati siano un importante contributore allo sviluppo di malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici, tra cui l’aterosclerosi e l’obesità. L’obiettivo di questo protocollo è quantificare l’attività chemiotattica dei monociti del sangue come biomarcatore per l’innesco e la disfunzione monociti e caratterizzare i monociti del sangue del fenomeno dei macrofagi sono pronti a differenziarsi in questi modelli murini. Utilizzando l’analisi a macchia occidentale a singola cellula, mostriamo che dopo 24 h 33% delle cellule reclutate in fedi di gel derivate dalla membrana seminterrato MCP-1 caricate nei topi sono monociti e macrofagi; 58% dopo il giorno 3. Tuttavia, il giorno 5, i numeri di monociti e macrofago sono diminuiti significativamente. Infine, mostriamo che questi saggi consentono anche l’isolamento dei macrofagi vivi dai tappi di gel derivati dalla membrana sotterranea, che possono quindi essere sottoposti a conseguente caratterizzazione mediante l’analisi di macchie occidentali a singola cellula.
Il reclutamento di macrofagi di origine monocite è essenziale per lo sviluppo di malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici, tra cui aterosclerosi e obesità1,2,3, 4. Il numero di macrofagi derivati da monociti nei siti di lesioni ai tessuti e la loro plasticità sono fondamentali per l’omeostasi dei tessuti e la riparazione. Sia il sotto- che l’esapico dei macrofagi derivati da monociti possono compromettere la guarigione delle ferite5. Innescando l’infiammazione dei tessuti locali, ad esempio, dall’accumulo e dall’ossidazione della lipoproteina a bassa densità (LDL) nella parete aortica o dall’attivazione infiammatoria di adipociti da acidi grassi o lipopolissaccofaride batterica che fuoriescono attraverso il barriera, porta al rilascio di mediatori infiammatori, comprese le chemiochine come la proteina chemiosante monocito-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 è un membro della famiglia chemiochina C-C e un chemioattraente chiave responsabile del reclutamento di macrofagi di origine monocitica in siti di infiammazione tissutale e lesioni6,7,8, 9,10. L’attivazione infiammatoria dell’endotelio vascolare determina l’espressione di adere molecole come la molecola di adesione intercellulare 1 (ICAM-1) e la molecola di adesione cellulare vascolare 1 (VCAM-1)11,12, monociti circolanti attivati da MCP-1 per rotolare, aderire fermamente e successivamente trasmigrare nello spazio subendoteliale12. Infiltrarsi monociti si differenziano in macrofagi, che possono essere attivati in un fenotipo infiammatorio, guidando il processo infiammatorio acuto. Guidati dal microambiente, i macrofagi pro-infiammatori possono convertirsi in macrofagi che risolvono l’infiammazione, che svolgono un ruolo critico nella cancellazione delle cellule infiammatorie, rimuovendo i segnali pro-infiammatori e completando la riparazione e la ferita dei tessuti guarigione12,13.
Primi monociti di stress metabolico cronico monociti per una reattività drammaticamente migliorata agli attrattivi di chemio e aumento del reclutamento di monociti, e abbiamo dimostrato che i monociti innescati danno origine a macrofagi con programmi di attivazione disregolati e polarizzazione Stati14,15,16. Monocyte priming promuove l’aterosclerosi, l’obesità, e possibilmente altre malattie infiammatorie croniche associate a disturbi metabolici come steatoepatite, malattie renali e possibilmente cancro. Per valutare e quantificare l’innesco monocito nei modelli murini delle malattie umane, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per valutare lo stato di innesco dei monociti del sangue misurando l’attività chemiotattica in vivo14,15,16, 17. Il nostro approccio prevede l’iniezione di gel derivato dalla membrana del seminterrato caricato con un chemioattraente – usiamo comunemente MCP-1 – o veicolo nel fianco sinistro e destro, rispettivamente, di topi. Quando iniettato con cura sottocutaneamente, il gel derivato dalla membrana del seminterrato formerà un singolo tappo, da cui le chemiochine possono diffondersi e creare un gradiente chemiotattico definito che non è influenzato dallo stato metabolico o infiammatorio dell’ambiente circostante tessuto o il mouse destinatario.
Il gel di base derivato dalla membrana che usiamo per il nostro saggio è una preparazione solubile della membrana del seminterrato estratta dal sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumore ricco di tali proteine a matrice extracellulare (ECM). Questa complessa miscela proteica contiene laminoina (60%), collagene IV (30%), la molecola di ponte entactin (8%) e una serie di fattori di crescita. Il test della spina a matrice a membrana seminterrato è stato originariamente sviluppato per studiare l’angiogenesi in risposta a vari fattori di crescita18,19. Tuttavia, al fine di studiare la chemiotassidi monocite, è importante utilizzare il gel di matrice derivata dalla membrana del seminterrato impoverito dal fattore di crescita per ridurre al minimo il reclutamento di cellule endoteliali e l’angiogenesi. Ciò che rende Matrigel (noto come gel derivato dalla membrana seminterrato d’ora in poi) unico e particolarmente utile è che a temperature inferiori ai 10 gradi si liquefa, permettendo lo scioglimento delle chemiochine. A temperature superiori ai 22 gradi centigradi, la soluzione derivata dalla membrana del seminterrato subisce rapidamente una transizione di fase e forma rapidamente un idrogel. Le spine possono essere ascise chirurgicamente, pulite e dissolte con una metalloproteasi neutra derivata da bacillo per produrre sospensioni a cella singola, che possono essere analizzate su una selezionatrice cellulare attivata a fluorescenza (FACS), da RNAseq, RNA a celle singole e una varietà di altri tecniche omiche. Qui descriviamo l’uso dell’analisi delle macchie occidentali unicellulari per la caratterizzazione delle popolazioni cellulari reclutate nei tappi di gel derivati dalla membrana seminterrato uno, tre o cinque giorni dopo l’iniezione.
Abbiamo sviluppato un saggio chemiotassico in vivo, sfruttando le proprietà fisiche uniche della matrice derivata dalla membrana del seminterrato e la capacità di caricare questa matrice unica con chemiochini e iniettarla nei topi. Il test ci permette di valutare nei topi viventi la reattività dei monociti (e dei macrofagi) alle chemiochini, come illustrato qui per MCP-1, e gli effetti della manipolazione genetica o delle esposizioni farmacologiche, alimentari e di altro tipo sul monocito Chemiotassi. Poiché il gradiente di chemiochina che creiamo in questi topi non è essenzialmente influenzato dall’esposizione genetica, farmacologica, alimentare o ambientale, i cambiamenti nell’attività chemiotattica monocite riflettono effettivamente i cambiamenti funzionali in questi monociti e, come abbiamo dimostrato in precedenza, anche la riprogrammazione sia a livello proteico che trascrizionale17,20. Abbiamo riferito che lo stress metabolico nei topi aumenta la reattività monocitica al chemiodontico e che questa attività iper-chemiotassica è correlata con l’aumento della proteina S-glutathionylation, un reversibile, redox-dipendente post-traduzionale modificazione delle proteine, che nella maggior parte dei casi porta alla perdita di energia enzimatica e proteica21,22, e in alcuni casi anche promuove la degradazione delle proteine16,23.
Per eseguire con successo questa procedura e per ottenere risultati ottimali con questo saggio è fondamentale che i volumi precisi di soluzione derivata dalla membrana seminterrato vengano iniettati lentamente per creare un singolare spina ben formata e capsule fibrose devono essere rimosse completamente per ottenere tappi puliti durante il raccolto scalzo membrana-derivato tappi tappi gel, facilita la dissoluzione dell’intero plug nella soluzione dispasi. I nostri dati mostrano che lasciare la spina negli animali per tre giorni ottimizza 1) l’intensità del segnale, cioè il numero di monociti e macrofagi reclutati in ogni spina, 2) la selettività del segnale, vale a dire il contenuto di monociti e macrofagi all’interno del popolazioni cellulari totali e 3) la specificità del segnale, vale a dire l’aumento dei monociti e dei macrofagi in risposta all’MCP-1 rispetto al veicolo. Infine, dimostriamo come approcci a cellule singole all’avanguardia in combinazione con l’analisi della spina in gel derivata dalla membrana del seminterrato possono essere utilizzati per caratterizzare i monociti reclutati nei tappi e ottenere così un’istantanea del potenziale fenotipo di i macrofagi di origine monocite vengono reclutati in siti di lesioni in qualsiasi modello murino in risposta a specifici interventi genetici, farmacologici, dietetici o ambientali.
Ci sono una serie di limitazioni del saggio da considerare. In primo luogo, la movimentazione del mouse, tra cui l’anestesia, l’iniezione di soluzione derivata dalla membrana seminterrato e la dissezione chirurgica richiede pratica per generare singoli tappi e dati riproducibili. In secondo luogo, mentre la maggior parte delle cellule reclutate nei tappi caricati MCP-1 sono monociti e macrofagi, un numero sostanziale non lo sono. Questo può influenzare l’interpretazione di altri saggi analitici non basati su singole cellule eseguiti su questa popolazione cellulare. Infine, poiché le condizioni di lisi cellulare per scWB sono lievi, le distanze di migrazione delle proteine possono differire dalla STRUTTURA DI confronto standard e non possono essere correlate alle dimensioni delle proteine. Pertanto, sia la lisi cellulare che i tempi di esecuzione devono essere convalidati per ogni nuova proteina da testare e per ogni anticorpo primario utilizzato.
The authors have nothing to disclose.
Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni a R.A. dal NIH (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |