هنا نقدم بروتوكولا لقياس النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية الدم في نماذج الماوس، لتقييم آثار التدخلات الغذائية والدوائية والوراثية على خلايا الدم وتوصيف خلايا الدم المستمدة من الضامة في نماذج الماوس باستخدام monocyte-chemoattractant البروتين-1 (MCP-1) محملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من المقابس هلام.
يعتمد توازن الأنسجة وإصلاحها بشكل حاسم على توظيف الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية. يمكن أن يؤدي كل من التجنيد الناقص والإفراطي في استخدام الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية إلى إعاقة التئام الجروح. أظهرنا أن الوجبات الغذائية عالية الدهون والسكر عالية تعزز فتيلة أحادية الخلايا وخلل وظيفي، وتحويل خلايا الدم الصحية إلى النمط الظاهري الكيميائي المفرط تستعد للتمييز إلى الضامة مع ملامح التنشيط dysregulated وضعف phenotypic اللدونه. ويعتقد أن الإفراط في توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية وتوظيف الضامة مع ملامح التنشيط dysregulated أن يكون مساهما رئيسيا في تطوير الأمراض الالتهابية المزمنة المرتبطة بالاضطرابات الأيضية، بما في ذلك تصلب الشرايين والسمنة. الهدف من هذا البروتوكول هو قياس النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الدم كعلامة حيوية لفتيلة الخلايا الأحادية واختلال وظيفي وتوصيف الخلايا الأحادية الدم النمط الظاهري الضامة تستعد للتمييز في هذه النماذج الماوس. باستخدام تحليل وصمة عار خلية واحدة الغربية، ونحن نظهر أنه بعد 24 ح 33٪ من الخلايا التي تم تجنيدها في MCP-1 المحملة الطابق السفلي غشاء المستمدة من المقابس هلام حقن في الفئران هي الخلايا الأحادية والضامة. 58% بعد اليوم الثالث. ومع ذلك، في اليوم 5، انخفضت بشكل ملحوظ في عدد الخلايا الأحادية والضامة. وأخيرا، نبين أن هذا الاختبارات يسمح أيضا لعزل الضامة الحية من المقابس هلام الطابق السفلي المستمدة من الغشاء يدويا جراحيا، والتي يمكن بعد ذلك أن تخضع لتوصيف لاحق من قبل خلية واحدة الغربية تحليل وصمة عار.
توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية أمر ضروري لتطوير الأمراض الالتهابية المزمنة المرتبطة بالاضطرابات الأيضية، بما في ذلك تصلب الشرايين والسمنة1،2،3، 4. عدد الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية في مواقع إصابة الأنسجة وكذلك اللدونة لها حاسمة لتوازن الأنسجة وإصلاحها. كل من نقص والإفراط في توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية يمكن أن يضعف التئام الجروح5. إثارة التهاب الأنسجة المحلية، على سبيل المثال، عن طريق تراكم وأكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) في الجدار الأبهري أو التنشيط الالتهابي للخلايا الدهنية من الأحماض الدهنية أو الليبوليساكاريد البكتيري ة التي تتسرب من خلال الأمعاء الحاجز، يؤدي إلى إطلاق الوسطاء الالتهابية، بما في ذلك chemokines مثل البروتين الكيميائي monocyte-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 هو عضو في عائلة C-C chemokine والكيميائية الرئيسية المسؤولة عن توظيف الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية لمواقع التهاب الأنسجة والإصابة6،7،8، 9،10. التنشيط الالتهابي للبطانة الوعائية يؤدي إلى التعبير عن جزيئات التصاق مثل جزيء التصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) وجزيء التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1)11،12، مما يسمح تعميم الخلايا الأحادية المنشطة من قبل MCP-1 للفة على طول، والتمسك بحزم وترحيل في وقت لاحق إلى الفضاء تحت البطانة12. التسلل الخلايا الأحادية تميز إلى الضامة، والتي يمكن تفعيلها في النمط الظاهري proinflammatory ، مما يؤدي إلى عملية التهابية حادة. مدفوعا بالبيئة الدقيقة، يمكن أن تتحول الضامة المؤيدة للالتهابات إلى الضامة حل التهاب، والتي تلعب أدوارا حاسمة في إزالة الخلايا الالتهابية، وإزالة الإشارات المؤيدة للالتهابات واستكمال إصلاح الأنسجة والجرح الشفاء12,13.
الإجهاد الأيضي المزمن رئيس الخلايا الأحادية لتعزيز كبير للاستجابة لجاذبية العلاج الكيميائي وزيادة تجنيد الخلايا الأحادية، وأظهرنا أن الخلايا الأحادية تستعد تؤدي إلى الضامة مع برامج التنشيط dysregulated والاستقطاب الولايات14،15،16. يعزز فتيلة Monocyte تصلب الشرايين والسمنة، وربما الأمراض الالتهابية المزمنة الأخرى المرتبطة بالاضطرابات الأيضية مثل التهاب الكبد الفكي وأمراض الكلى وربما السرطان. لتقييم وقياس فتيلة الخلايا الأحادية في نماذج الماوس من الأمراض البشرية، قمنا بتطوير تقنية جديدة لتقييم الحالة فتيلة من خلايا الدم عن طريق قياس النشاط الكيميائي في الجسم الحي14،15،16، 17. نهجنا ينطوي على حقن هلام الغشاء الطابق السفلي المستمدة محملة إما chemoattractant – ونحن عادة استخدام MCP-1 – أو مركبة في الجناح الأيسر والأيمن، على التوالي، من الفئران. عندما حقن بعناية تحت الجلد، فإن هلام الطابق السفلي الغشاء المستمدة من تشكيل قابس واحد، والتي يمكن أن تنتشر chemokines وخلق التدرج الكيميائي المحدد الذي لا يتأثر الحالة الأيضية أو الالتهابية من المحيطة الأنسجة أو الماوس المتلقي.
الجل المشتق من الغشاء في الطابق السفلي الذي نستخدمه في اختبارنا هو إعداد غشاء الطابق السفلي المنسع المستخرج من ساركوما الماوس Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)، وهو ورم غني ببروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). يحتوي خليط البروتين المعقد هذا على اللامينين (60٪)، الكولاجين الرابع (30٪)، وجزيء الإنأكتين (8٪)، وعدد من عوامل النمو. تم تطوير الغشاء السفلي مصفوفة المكونات في الأصل للتحقيق في تكوين الأوعية استجابة لمختلف عوامل النمو18،19. ومع ذلك، من أجل دراسة الخلايا الكيميائية أحادية، من المهم استخدام عامل النمو المنضب في الطابق السفلي هلام الغشاء المستمدة من البطانية للحد من تجنيد الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية. ما يجعل Matrigel (يشار إليها باسم هلام الطابق السفلي الغشاء المستمدة من الآن فصاعدا) فريدة من نوعها ومفيدة بشكل خاص هو أنه في درجات الحرارة أقل من 10 درجة مئوية فإنه تسييل، مما يسمح لchemokines أن يذوب. في درجات حرارة أعلى من 22 درجة مئوية، الحل السفلي الغشاء المستمدة يخضع بسرعة مرحلة الانتقال ويشكّل بسرعة هيدروجيل. المقابس يمكن استئصالها جراحيا، وتنظيفها وحلها مع العصوية المستمدة من metalloprotease محايدة لإنتاج تعليق خلية واحدة، والتي يمكن تحليلها على فارز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، من قبل RNAseq، RNA خلية واحدة ومجموعة متنوعة من غيرها من تقنيات omics. هنا نقوم بوصف استخدام تحليل اللطخة الغربية أحادية الخلية لتوصيف مجموعات الخلايا التي تم تجنيدها في الطابق السفلي المقابس هلام المستمدة من الغشاء واحد أو ثلاثة أو خمسة أيام بعد الحقن.
قمنا بتطوير اختبار chemotaxis في الجسم الحي، والاستفادة من الخصائص الفيزيائية الفريدة للمصفوفة المستمدة من الغشاء الطابق السفلي والقدرة على تحميل هذه المصفوفة الفريدة مع chemokines وحقنه في الفئران. يسمح لنا الفحص بتقييم استجابة الخلايا الأحادية (والضامة) إلى الكيماويات في الفئران الحية (والضامة) إلى الكيماويات، كما هو موضح هنا بالنسبة MCP-1، وآثار التلاعب الوراثي أو التعرض الدوائي والغذائي وغير ذلك من التعرض البيئي على الخلايا الأحادية العلاج الكيميائي. لأن التدرج الكيميائي الذي نخلقه في هذه الفئران لا يتأثر أساسا بالتعرض الوراثي أو الدوائي أو الغذائي أو البيئي، فإن التغيرات في النشاط الكيميائي الأحادي تعكس في الواقع التغيرات الوظيفية في هذه الخلايا الأحادية، وكما أظهرنا سابقا، أيضا إعادة برمجة على حد سواء على مستوى البروتين والنسخ17،20. أبلغنا أن الإجهاد الأيضي في الفئران يزيد من استجابة الخلايا الأحادية للجاذبية الكيميائية وأن هذا النشاط الكيميائي المفرط يرتبط مع زيادة البروتين S-glutathionylation، عكسها، ردوإكس تعتمد على ما بعد الترجمة تعديل البروتين، مما يؤدي في معظم الحالات إلى فقدان وظيفة الأنزيمية والبروتين21،22، وفي بعض الحالات حتى يعزز تدهور البروتين16،23.
لتنفيذ هذا الإجراء بنجاح والحصول على النتائج المثلى مع هذا القول من الأهمية بمكان أن يتم حقن كميات دقيقة من الحل المستمدة من غشاء الطابق السفلي ببطء لخلق المكونات فريدة من نوعها شكلت بشكل جيد وينبغي إزالة كبسولات ليفية تماما للحصول على المقابس نظيفة عند حصاد الطابق السفلي المقابس هلام المستمدة من الغشاء، ويسهل حل المكونات بأكملها في حل dispase. تظهر بياناتنا أن ترك المكونات في الحيوانات لمدة ثلاثة أيام يحسن 1) كثافة الإشارة، أي عدد الخلايا الأحادية والضامة التي تم تجنيدها في كل قابس، 2) انتقائية الإشارة، أي محتوى الخلايا الأحادية والضامة داخل مجموع مجموعات الخلايا و 3) خصوصية الإشارة، أي الزيادة في الخلايا الأحادية والضامة استجابة لMCP-1 مقارنة مع السيارة. وأخيرا، نبين كيف يمكن استخدام أحدث المناهج القائمة على خلية واحدة جنبا إلى جنب مع مسح المكونات هلام المستمدة من غشاء الطابق السفلي لتوصيف الخلايا الأحادية التي تم تجنيدها في المقابس وبالتالي الحصول على لقطة من النمط الظاهري المحتمل لل الضامة المستمدة من الخلايا الأحادية التي يتم تجنيدها في مواقع الإصابة في أي نموذج ماوس معين استجابة لتدخلات وراثية أو دوائية أو غذائية أو بيئية محددة.
وهناك عدد من القيود على التبيّن الذي يتعين النظر فيه. أولا، التعامل مع الماوس، بما في ذلك التخدير، وحقن الحل السفلي الغشاء المستمدة، وتشريح الجراحية يتطلب ممارسة لتوليد المقابس واحدة والبيانات القابلة للاستنساخ. ثانيا، في حين أن معظم الخلايا التي تم تجنيدها في المقابس المحملة MCP-1 هي الخلايا الأحادية والضامة، وعدد كبير ليست كذلك. وقد يؤثر ذلك على تفسير الاختبارات التحليلية الأخرى غير القائمة على خلية واحدة التي أجريت على هذه الخلايا. وأخيراً، بما أن ظروف تحليل الخلايا لـ scWB خفيفة، فقد تختلف مسافات الهجرة من البروتينات عن البنك الدولي القياسي وقد لا ترتبط بحجم البروتين. لذلك، كل من تحليل الخلية وأوقات التشغيل يجب التحقق من صحة لكل بروتين جديد ليتم اختباره واستخدام كل الأجسام المضادة الأساسية.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا المشروع بمنح إلى R.A. من المعاهد الوطنية للصحة (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |