在这里,我们提出一个协议,以量化小鼠模型中血液单核细胞的化学活性,评估营养、药理和遗传干预对血液单核细胞的影响,并描述在小鼠模型中产生的血单核细胞使用单核细胞-化学吸引蛋白-1(MCP-1)加载的基底膜衍生凝胶塞的小鼠模型。
组织平衡和修复严重依赖单细胞衍生巨噬细胞的招募。单细胞衍生巨噬细胞的不足和过度招募都会损害伤口愈合。我们表明,高脂肪和高糖饮食促进单核细胞启动和功能障碍,将健康的血液单核细胞转化为一种超化学性表型,随时准备分化成具有调节激活特征和受损的表型的巨噬细胞可塑性。过度招募单核衍生巨噬细胞和招募具有调节障碍活化特征的巨噬细胞被认为是导致与代谢紊乱有关的慢性炎症性疾病发展的主要原因,包括动脉粥样硬化和肥胖。该协议的目标是量化血液单核细胞的化学活性,作为单核细胞启动和功能障碍的生物标志物,并描述巨噬细胞表型血单核细胞在这些小鼠模型中的特性。利用单细胞西斑分析,结果表明,24 h 33%的细胞被吸收到MCP-1加载的基底膜衍生凝胶塞中注入小鼠后是单核细胞和巨噬细胞;58% 后 3 天。然而,第5天,单核细胞和巨噬细胞数量显著减少。最后,我们表明,该测定还允许从手术检索的基底膜衍生凝胶塞分离活巨噬细胞,然后通过单细胞西斑分析进行后续表征。
单核细胞衍生巨噬细胞的招募对于与代谢紊乱有关的慢性炎症疾病的发展至关重要,包括动脉粥样硬化和肥胖1,2,3 4.组织损伤部位的单核衍生巨噬细胞数量及其可塑性对组织平衡和修复至关重要。单细胞衍生巨噬细胞的不足和过度招募都会损害伤口愈合5。引发局部组织炎症,例如,通过低密度脂蛋白 (LDL) 在主动脉壁的积累和氧化,或通过肠道泄漏的细菌脂多糖对脂肪细胞的炎症激活屏障,导致炎症介质的释放,包括化疗素,如单核细胞化学吸引蛋白-1(MCP-1/CCL2)。MCP-1是C-C化学素家族的成员,也是负责在组织炎症和损伤部位招募单核细胞衍生巨噬细胞的关键化学吸引剂6,7,8 9,10.血管内皮的炎症活化导致粘附分子的表达,如细胞间粘附分子1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)11,12,允许由MCP-1激活的循环单核细胞滚动,牢固地粘附并随后移入下直肠空间12。渗透单核细胞分化成巨噬细胞,可以激活成亲炎表型,推动急性炎症过程。在微环境的驱动下,亲炎巨噬细胞可以转化为炎症解析巨噬细胞,在清除炎症细胞、消除亲炎信号和完成组织修复和伤口方面起着至关重要的作用愈合12,13。
慢性代谢压力使单核细胞对化疗吸引物的反应显著增强,并增加了单核细胞的招募,我们表明,充血的单核细胞产生巨噬细胞,具有调节不良的活化程序和极化州14,15,16。单核细胞启动促进动脉粥样硬化,肥胖,可能与其他慢性炎症疾病,如脂肪瘤,肾脏疾病和可能癌症。为了评估和量化人类疾病小鼠模型中的单核细胞启动,我们开发了一种新技术,通过测量体内的化学活性14、15、16,来评估血液单核细胞的启动状态。 17.我们的方法包括将底膜衍生凝胶注入,其中要么装有化学吸引剂(我们通常使用 MCP-1),要么分别注入小鼠的左右侧翼。当仔细注射皮下,基底膜衍生凝胶将形成一个单一的插头,其中化学因子可以扩散,并创建一个定义的化学梯度,不受周围代谢或炎症状态的影响组织或受体小鼠。
我们用于测定的基底膜衍生凝胶是从恩格尔布雷斯-霍尔姆-肖姆(EHS)小鼠肉瘤中提取的溶解基底膜制剂,这种肿瘤富含这种细胞外基质(ECM)蛋白质。这种复杂的蛋白质混合物含有层蛋白(60%)、胶原蛋白IV(30%)、桥接分子定木蛋白(8%)和多种生长因子。地下室膜基塞塞测定最初是为研究血管生成而开发的,以响应各种生长因子18,19。然而,为了研究单细胞化学,重要的是使用生长因子耗尽的基底膜衍生凝胶,以尽量减少内皮细胞的招募和血管生成。Matrigel(称为基底膜衍生凝胶)之所以独特,而且特别有用,是在低于10°C的温度下,它液化,允许化学素溶解。在22°C以上的温度下,基底膜衍生溶液快速经历相变,并迅速形成水凝胶。这些插头可以通过细菌衍生的中性金属蛋白酶进行手术切除、清洁和溶解,从而产生单细胞悬浮液,可在荧光活性细胞分拣机(FACS)、RNA、单细胞RNA和各种其他酶中进行分析omics 技术。在这里,我们描述了使用单细胞西斑分析来描述细胞群的表征招募到地下室膜衍生凝胶塞1,3或5天后注射。
我们开发了一种体内化学化学测定,利用基底膜衍生基质的独特物理特性,以及用化学基质加载这种独特的基质并将其注射到小鼠体内的能力。该测定使我们能够评估活小鼠对化学细胞(和巨噬细胞)的反应能力,如MCP-1所示,以及基因操纵或药理学、饮食和其他环境暴露对单核细胞的影响趋 化。由于我们在这些小鼠中创造的化学梯度基本上不受遗传、药理学、饮食或环境暴露的影响,单核细胞化学策略活性的变化实际上反映了这些单核细胞的功能变化,正如我们所展示的以前,也重新编程在蛋白质和转录水平17,20。我们报告说,小鼠的代谢应激增加单细胞对化学吸引剂的反应,这种超化学性活性与增加的蛋白质S-谷氨酸化相关,一种可逆的,依赖氧化还原的后转化蛋白质修饰,在大多数情况下导致酶和蛋白质功能的损失21,22,在某些情况下甚至促进蛋白质降解16,23。
为了成功执行这一程序并获得最佳结果,通过这种测定,必须缓慢地注入准确的基底膜衍生溶液,以创建一个奇异的成形良好的塞和纤维胶囊。完全获得清洁插头时收获地下室膜衍生凝胶插头,有利于溶解整个插头在消生溶液。我们的数据表明,将插头留在动物体内三天可优化 1) 信号强度,即每个插头中招募的单核细胞和巨噬细胞的数量,2) 信号的选择性,即单核细胞和巨噬细胞在总细胞群和3)信号的特异性,即单核细胞和巨噬细胞在MCP-1响应时与车辆相比的增加。最后,我们演示了如何利用最先进的单细胞方法与基底膜衍生凝胶插头测定一起,对插入插头中的单核细胞进行表征,从而获得潜在表型的快照。单细胞衍生巨噬细胞被招募到任何给定小鼠模型中的损伤部位,以响应特定的遗传、药理学、饮食或环境干预。
要考虑的测定有若干限制。首先,小鼠处理,包括麻醉,注射地下室膜衍生溶液,和手术解剖需要实践产生单插头和可重复的数据。其次,虽然大多数被招募到MCP-1加载插头的细胞是单核细胞和巨噬细胞,但相当多的细胞不是。这可能会影响对该细胞群执行的其他非单细胞分析分析分析的解释。最后,由于scWB的细胞分裂条件温和,蛋白质的迁移距离可能与标准WB不同,可能与蛋白质大小无关。因此,细胞解毒和运行时间都必须验证每个要测试的新蛋白质和使用的每个主要抗体。
The authors have nothing to disclose.
该项目得到了国家卫生研究院(AT006885)对R.A.的资助。
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |