Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la actividad quimiotáctica de los monocitos sanguíneos en modelos de ratón, para evaluar los efectos de las intervenciones nutricionales, farmacológicas y genéticas en los monocitos sanguíneos y para caracterizar los monocitos sanguíneos derivados de los macrófagos en modelos de ratón utilizando tapones de gel de membrana de sótano cargados de monocitos-quimioattractant-1 (MCP-1).
La homeostasis tisular y la reparación dependen críticamente del reclutamiento de macrófagos derivados de monocitos. Tanto el reclutamiento bajo como el sobrereclutamiento de macrófagos derivados de monocitos pueden afectar la cicatrización de heridas. Demostramos que las dietas altas en grasas y altos en azúcar promueven el cebado y la disfunción de los monocitos, convirtiendo los monocitos sanguíneos sanos en un fenotipo hiperquiotáctico preparado para diferenciarse en macrófagos con perfiles de activación desregulados y fenotípicos deteriorados Plasticidad. Se cree que el sobrereclutamiento de macrófagos derivados de monocitos y el reclutamiento de macrófagos con perfiles de activación disregulados contribuyen de manera importante al desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas asociadas con trastornos metabólicos, incluyendo aterosclerosis y obesidad. El objetivo de este protocolo es cuantificar la actividad quimiotáctica de los monocitos sanguíneos como biomarcador para el cebado y la disfunción de los monocitos y caracterizar los monocitos sanguíneos del fenotipo macrofago están listos para diferenciarse en estos modelos de ratón. Usando el análisis de una sola célula de Western blot, mostramos que después de 24 h 33% de las células reclutadas en tapones de gel derivados de membrana de sótano cargados MCP-1 inyectados en ratones son monocitos y macrófagos; 58% después del día 3. Sin embargo, en el día 5, el número de monocitos y macrófagos disminuyó significativamente. Por último, demostramos que estos ensayos también permiten el aislamiento de macrófagos en vivo de los tapones de gel derivados de membranas de sótano recuperados quirúrgicamente, que luego pueden ser sometidos a la caracterización posterior mediante el análisis de una sola célula occidental.
El reclutamiento de macrófagos derivados de monocitos es esencial para el desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas asociadas con trastornos metabólicos, incluyendo aterosclerosis y obesidad1,2,3, 4. El número de macrófagos derivados de monocitos en los sitios de lesión tisular, así como su plasticidad son críticos para la homeostasis tisular y la reparación. Tanto el reclutamiento bajo como el sobrereclutamiento de macrófagos derivados de monocitos pueden afectar la cicatrización de heridas5. Desencadenar la inflamación del tejido local, por ejemplo, por la acumulación y oxidación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la pared aórtica o activación inflamatoria de adipocitos por ácidos grasos o fuga de lipopolisacárido bacteriano a través del intestino intestinal barrera, conduce a la liberación de mediadores inflamatorios, incluyendo quimioquinas como la proteína quimioattractante de monocitos-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 es un miembro de la familia de la quimioquina C-C y un quimioatractor clave responsable del reclutamiento de macrófagos derivados de monocitos en sitios de inflamación y lesión de tejidos6,7,8, 9,10. La activación inflamatoria del endotelio vascular da como resultado la expresión de moléculas de adherencia como la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y la molécula de adhesión de células vasculares 1 (VCAM-1)11,12, permitiendo monocitos circulantes activados por MCP-1 para rodar a lo largo, adherirse firmemente y posteriormente transmigrar al espacio subendotelial12. Los monocitos infiltrados se diferencian en macrófagos, que pueden activarse en un fenotipo proinflamatorio, impulsando el proceso inflamatorio agudo. Impulsados por el microambiente, los macrófagos proinflamatorios pueden convertirse en macrófagos que resuelven la inflamación, que desempeñan un papel crítico en la limpieza de células inflamatorias, la eliminación de señales proinflamatorias y la reparación y herida completación del tejido curación12,13.
El estrés metabólico crónico prepara los monocitos para mejorar drásticamente la capacidad de respuesta a los quimio-atractores y aumentar el reclutamiento de monocitos, y demostramos que los monocitos cebados dan lugar a macrófagos con programas de activación y polarización regulados y polarización estados14,15,16. El cebado de monocitos promueve la aterosclerosis, la obesidad y posiblemente otras enfermedades inflamatorias crónicas asociadas con trastornos metabólicos como la esteatohepatitis, las enfermedades renales y posiblemente el cáncer. Para evaluar y cuantificar el cebado de monocitos en modelos de ratón de enfermedades humanas, desarrollamos una nueva técnica para evaluar el estado de cebado de los monocitos sanguíneos midiendo la actividad quimiotáctica in vivo14,15,16, 17. Nuestro enfoque consiste en la inyección de gel derivado de membrana de sótano cargado con un quimioattractante —utilizamos comúnmente MCP-1— o vehículo en el flanco izquierdo y derecho, respectivamente, de ratones. Cuando se inyecta cuidadosamente por vía subcutánea, el gel derivado de la membrana del sótano formará un único tapón, del cual las quimioquinas pueden difundir y crear un gradiente quimiotáctico definido que no se ve afectado por el estado metabólico o inflamatorio de los alrededores tejido o el ratón receptor.
El gel derivado de membrana de sótano que utilizamos para nuestro ensayo es una preparación de membrana de sótano solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumor rico en proteínas de matriz extracelular (ECM). Esta compleja mezcla de proteínas contiene laminina (60%), colágeno IV (30%), la molécula de puente entactin (8%) y una serie de factores de crecimiento. El ensayo de tapón de matriz de membrana del sótano fue desarrollado originalmente para investigar la angiogénesis en respuesta a varios factores de crecimiento18,19. Sin embargo, con el fin de estudiar la quimiotaxis monocitos, es importante utilizar gel derivado de membrana sótano de supuse el factor de crecimiento para minimizar el reclutamiento de células endoteliales y la angiogénesis. Lo que hace que Matrigel (denominado gel derivado de membrana de sótano a partir de ahora) sea único y particularmente útil es que a temperaturas por debajo de 10oC se licua, permitiendo que las quimiocinas se disuelvan. A temperaturas superiores a 22oC, la solución derivada de la membrana del sótano pasa rápidamente por una transición de fase y forma rápidamente un hidrogel. Los tapones pueden ser extirpados quirúrgicamente, limpiados y disueltos con una metaloproteasa neutra derivada de bacilo para producir suspensiones de una sola célula, que se pueden analizar en un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS), por RNAseq, ARN de una sola célula y una variedad de otros técnicas de omics. Aquí describimos el uso de análisis de manchas occidentales de una sola célula para la caracterización de las poblaciones celulares reclutadas en los tapones de gel derivados de membrana del sótano uno, tres o cinco días después de la inyección.
Desarrollamos un ensayo quimiotaxis in vivo, haciendo uso de las propiedades físicas únicas de la matriz derivada de la membrana del sótano y la capacidad de cargar esta matriz única con quimiolinas e inyectarla en ratones. El ensayo nos permite evaluar en ratones vivos la capacidad de respuesta de los monocitos (y macrófagos) a las quimioquinas, como se ilustra aquí para MCP-1, y los efectos de la manipulación genética o las exposiciones farmacológicas, dietéticas y otras exposiciones ambientales en monocitos Quimiotactismo. Debido a que el gradiente de quimiocina que creamos en estos ratones no se ve esencialmente afectado por la exposición genética, farmacológica, dietética o ambiental, los cambios en la actividad quimiotáctica de los monocitos reflejan realmente los cambios funcionales en estos monocitos y, como mostramos anteriormente, también la reprogramación tanto a nivel proteico como transcripcional17,20. Informamos que el estrés metabólico en ratones aumenta la capacidad de respuesta de los monocitos a la quimioattractante y que esta actividad hiperquimiotáctica se correlaciona con el aumento de la proteína S-glutathionylation, una posttranslacional reversible, dependiente de redox modificación de proteínas, que en la mayoría de los casos conduce a la pérdida de la función enzimática y proteica21,22, y en algunos casos incluso promueve la degradación de las proteínas16,23.
Para ejecutar con éxito este procedimiento y para obtener resultados óptimos con este ensayo es fundamental que los volúmenes precisos de la solución derivada de membrana de sótano se inyectan lentamente para crear un tapón singular bien formado y las cápsulas fibrosas deben ser eliminados completamente para obtener tapones limpios cuando cosecha tapones de gel derivados de membrana sótano, facilita la disolución de todo el enchufe en la solución de dispensación. Nuestros datos muestran que dejar el enchufe en los animales durante tres días optimiza 1) la intensidad de la señal, es decir, el número de monocitos y macrófagos reclutados en cada enchufe, 2) la selectividad de la señal, es decir, el contenido de monocitos y macrófagos dentro del total de poblaciones celulares y 3) la especificidad de la señal, es decir, el aumento de monocitos y macrófagos en respuesta a MCP-1 en comparación con el vehículo. Por último, demostramos cómo los enfoques de última generación basados en células únicas junto con el ensayo de tapón de gel derivado de la membrana del sótano se pueden utilizar para caracterizar a los monocitos reclutados en los enchufes y así obtener una instantánea del fenotipo potencial de los macrófagos derivados de monocitos que se reclutan en sitios de lesión en cualquier modelo de ratón dado en respuesta a intervenciones genéticas, farmacológicas, dietéticas o ambientales específicas.
Hay una serie de limitaciones del ensayo a tener en cuenta. En primer lugar, el manejo del ratón, incluida la anestesia, la inyección de la solución derivada de la membrana del sótano y la disección quirúrgica, requiere la práctica para generar enchufes individuales y datos reproducibles. En segundo lugar, mientras que la mayoría de las células reclutadas en los tapones cargados MCP-1 son monocitos y macrófagos, un número sustancial no lo son. Esto puede afectar la interpretación de otros ensayos analíticos no basados en células únicas realizados en esta población celular. Por último, dado que las condiciones de lisis celular para el scWB son leves, las distancias de migración de proteínas pueden diferir de la WB estándar y no pueden correlacionarse con el tamaño de la proteína. Por lo tanto, tanto la lisis celular como los tiempos de ejecución deben validarse para cada nueva proteína que se va a probar y cada anticuerpo primario utilizado.
The authors have nothing to disclose.
Este proyecto fue apoyado por subvenciones a R.A. del NIH (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |