ここでは、マウスモデルにおける血液単球の化学的活性を定量化し、血液単球に対する栄養、薬理学的および遺伝的介入の影響を評価し、マクロファージ由来の血液単球を特徴付けるプロトコルを提示する。単球化学集性タンパク質-1(MCP-1)装填系地下膜由来ゲルプラグを用いてマウスモデルを用いる。
組織恒常性および修復は、単球由来マクロファージの採用に大きく依存する。単球由来マクロファージの過少および過剰募集の両方が創傷治癒を損なう可能性があります。我々は、高脂肪および高糖質食が単球プライミングおよび機能不全を促進し、健康な血液単球を超化学的表現型に変換し、調節不全活性化プロファイルとプロノチピック障害を有するマクロファージに分化することを示した。可塑性。単球由来マクロファージの過剰募集と調節不全活性化プロファイルを有するマクロファージの募集は、代謝障害に関連する慢性炎症性疾患の発症に大きく寄与すると考えられている。アテローム性動脈硬化症および肥満を含む。このプロトコルの目的は、単球プライミングおよび機能不全のバイオマーカーとしての血液単球の化学的活性を定量化し、これらのマウスモデルで分化する準備ができているマクロファージ表現型血液単球を特徴付けることです。単一細胞ウェスタンブロット分析を用いて、マウスに注入されたMCP-1装填地下膜由来ゲルプラグに募集された細胞の24時間33%が単球およびマクロファージであることを示した。3日目以降58%。しかし、5日目には、単球およびマクロファージ数が有意に減少した。最後に、このアッセイは、外科的に取り出された地下膜由来ゲルプラグからの生きたマクロファージの単離も可能であり、その後、単細胞ウェスタンブロット分析によって後続の特性化を受けることができることを示す。
単球由来マクロファージの募集は、アテローム性動脈硬化症および肥満を含む代謝障害に関連する慢性炎症性疾患の発症に不可欠である1,2,3, 4.組織損傷部位における単球由来マクロファージの数およびその可塑性は、組織恒常性および修復に不可欠である。単球由来マクロファージの過少および過剰募集の両方が創傷治癒5を損なう可能性がある。局所組織の炎症を引き起こす、例えば、大動脈壁における低密度リポタンパク質(LDL)の蓄積および酸化または脂肪酸または腸を通って漏出する細菌リポ多糖による脂肪細胞の炎症活性化によってバリアは、単球化学集性タンパク質-1(MCP-1/CCL2)などのケモカインを含む炎症メディエーターの放出につながる。MCP-1はC-Cケモカインファミリーの一員であり、組織の炎症および損傷の部位に単球由来マクロファージの募集を担当する主要な化学刺激剤6,7,8、 9,10.血管内皮の炎症活性化は、細胞間接着分子1(ICAM-1)および血管細胞接着分子1(VCAM-1)11、12などの接着分子の発現をもたらす。MCP-1によって活性化される循環単球は、一緒に転がり、しっかりと付着し、その後、下皮空間12に移行する。浸潤単球はマクロファージに分化し、これは炎症性表現型に活性化され、急性炎症過程を駆動する。微小環境によって駆動される、炎症性マクロファージは炎症を解決するマクロファージに変換することができ、炎症細胞の除去、炎症性シグナルの除去、組織修復および創傷の完了に重要な役割を果たすヒーリング12,13.
慢性代謝ストレス素数は、化学集客剤に対する応答性を飛躍的に高め、単球の募集を増加させ、プライム式単球が調節不変活性化プログラムと偏光を伴うマクロファージを生じることを示した。状態14,15,16.単球プライミングは、アテローム性動脈硬化症、肥満、およびおそらく脂肪性肝炎、腎臓病およびおそらく癌などの代謝障害に関連する他の慢性炎症性疾患を促進する。ヒト疾患のマウスモデルにおける単球プライミングを評価・定量化するために、生体内14,15,16における化学的活性を測定することにより、血液単球のプライミング状態を評価する新しい手法を開発した。 17.我々のアプローチは、化学刺激剤を搭載した地下膜由来ゲルの注入を含む- 我々は一般的に、マウスの左右の側面にMCP-1を使用するか、または車両をそれぞれ使用する。皮下に慎重に注入すると、基板由来ゲルは単一のプラグを形成し、そこからケモカインが拡散し、周囲の代謝または炎症状態の影響を受けない定義された化学的勾配を作成します。組織またはレシピエントマウス。
我々のアッセイに用いられる地下膜由来ゲルは、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫から抽出された可溶化地下膜製剤であり、このような細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を豊富に有する腫瘍である。この複雑なタンパク質混合物は、ラミニン(60%)、コラーゲンIV(30%)、ブリッジング分子エンタクチン(8%)、および多くの成長因子を含有する。地下膜マトリックスプラグアッセイは、もともと様々な成長因子18,19に応答して血管新生を調べるために開発された。しかし、単球化学症を研究するためには、成長因子枯渇した地下膜由来ゲルを使用して、内皮細胞の募集と血管新生を最小限に抑えることが重要です。マトリゲル(地下膜由来ゲルと呼ばれる)がユニークで特に有用なのは、10°C未満の温度で液化し、ケモカインを溶解させることです。22°Cを超える温度では、地下膜由来溶液は急速に相転移を経て、急速にヒドロゲルを形成する。プラグは、外科的に切除、洗浄、バチルス由来のニュートラルメタロプトーゼで溶解し、単一細胞懸濁液を得ることができ、これは、RNAAceq、単一細胞RNAおよび他の様々な蛍光活性化細胞選別機(FACS)で分析することができる。オミクスのテクニック。ここでは、注射後1、3、5日後に地下膜由来ゲルプラグに募集された細胞集団の特徴付けに対する単細胞ウェスタンブロット分析の使用について説明する。
我々は、地下膜由来マトリックスのユニークな物理的特性と、このユニークなマトリックスをケモカインでロードし、マウスに注入する能力を利用して、生体内ケモタキシスアッセイを開発しました。このアッセイにより、MCP-1に示すように、生きているマウスにおける単球(およびマクロファージ)のケモカインへの応答性、および遺伝子操作または薬理学的、食事および他の環境暴露が単球に及ぼす影響を評価することができます。ケモタキシス。これらのマウスで作成するケモカイン勾配は、遺伝的、薬理学的、食事的または環境的暴露の影響を受けないため、単球分光活性の変化は実際にこれらの単球の機能変化を反映し、我々が示したように以前は、タンパク質と転写レベル17、20の両方でリプログラミングも行う。マウスの代謝ストレスは、化学集動性に対する単球応答性を増加させ、この超化学的活性は、可逆的な、レドックス依存性のポストトランスプライアルである増加したタンパク質S-グルタチオニル化と相関することを報告した。タンパク質修飾は、ほとんどの場合、酵素およびタンパク質機能21、22の喪失を引き起こし、場合によってはタンパク質分解16、23を促進する。
この手順を正常に実行し、このアッセイで最適な結果を得るためには、地下膜由来溶液の正確な量をゆっくりと注入して、特異な整形プラグと繊維状カプセルを除去することが重要です。完全に地下膜由来ゲルプラグを収穫するときにきれいなプラグを取得するために、ディスパーゼ溶液中のプラグ全体の溶解を容易にします。我々のデータは、3日間動物にプラグを残すことは、1)信号強度、すなわち、各プラグに募集された単球およびマクロファージの数、2)信号の選択性、すなわち、単球およびマクロファージ内の単球およびマクロファージの含有量を最適化することを示している。総細胞集団および3)信号の特異性、すなわち車両と比較してMCP-1に応答する単球およびマクロファージの増加。最後に、基幹膜由来ゲルプラグアッセイと組み合わせて最先端の単一細胞ベースのアプローチを使用して、プラグに採用された単球を特徴付け、潜在的な表現型のスナップショットを得る方法を示します。特定の遺伝的、薬理学的、食事的または環境的介入に応答して、任意の特定のマウスモデルの傷害部位に募集される単球由来マクロファージ。
考慮されるべきアッセイの多くの制限がある。まず、マウスの取り扱い、麻酔、基基膜由来溶液の注入、および外科的解剖は、単一のプラグと再現可能なデータを生成する練習を必要とする。第二に、MCP-1ロードプラグに募集されたほとんどの細胞は単球およびマクロファージであるが、かなりの数はそうではありません。これは、この細胞集団に対して行われる他の非単一細胞ベースの分析アッセイの解釈に影響を与える可能性がある。最後に、scWBの細胞リシス条件は軽度であるため、タンパク質の移動距離は標準WBとは異なり、タンパク質サイズと相関しない場合があります。したがって、細胞リシスとランタイムの両方を、試験する新しいタンパク質と使用される各一次抗体について検証する必要があります。
The authors have nothing to disclose.
このプロジェクトは、NIH(AT006885)からのR.A.への助成金によって支援されました。
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |