Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo
Summary
Este protocolo describe un ensayo de invasión vertical invertido que podría ser utilizado para cuantificar la capacidad de migración y la invasión de las células en un entorno tridimensional conservando el microambiente celular. Este ensayo es adecuado para las células raras o sensibles.
Abstract
Aunque se han desarrollado ensayos de invasión 3D, el desafío sigue siendo estudiar las células sin afectar la integridad de su microambiente. 3D tradicionales ensayos tales como el compartimiento de Boyden requieren que las células son desplazadas de la ubicación original de la cultura y se trasladó a un nuevo entorno. No sólo hace esto interrumpir los procesos celulares que son intrínsecos al microentorno, pero a menudo resulta en una pérdida de células. Estos problemas son especialmente difíciles cuando se trata de las células que son raros, o extremadamente sensibles a su microambiente. Aquí, describimos el desarrollo de un ensayo de invasión 3D que evita ambos problemas. En este ensayo, las células se platean dentro de un pequeño bien y una matriz del ECM que contiene un chemoattractant se coloca encima de las células. Esto no requiere desplazamiento de la célula y permite a las células invadir hacia arriba en la matriz. En este ensayo, invasión celular y morfología celular puede ser evaluada en el gel de colágeno. Usando este análisis, se caracteriza la capacidad invasiva de las células raras y sensibles; las células híbridas resultantes de la fusión entre las células de cáncer de mama MCF7 y mesenquimales multipotentes/tallo/estroma células (MSCs).
Introduction
La motilidad celular es un proceso fisiológico y de desarrollo normal de las células. Sin embargo, cambios en el patrón y la capacidad de las células para migrar e invadir están asociados a condiciones patológicas como enfermedades inflamatorias y cáncer metástasis1,2,3. La metástasis es posiblemente el aspecto más mal entendido en cáncer. Para metástasis, las células cancerosas deben degradar la matriz extracelular (ECM), invaden el tejido local y intravasate. Una vez en circulación, las células cancerosas se difundir el sitio distante extravasate y formar tumores secundarios. Por lo tanto, la capacidad de las células para degradar el ECM, a migrar y a invadir se relaciona con su potencial metastásico. Han desarrollado diferentes enfoques para analizar y cuantificar las capacidades de migración y la invasión de las células. Los enfoques más utilizados incluyen la cicatrización ensayo, microscopía Time-lapse y el análisis de la cámara de Boyden. La herida curativo ensayo4 y tiempo lapso microscopia son ensayos simples y convenientes que darían visión preliminar de migración de la célula. Sin embargo, ambos son ensayos 2D que reflejan el entorno 3D en el que las células existen en vivo. Los estudios han demostrado que las células responden de manera diferente a un entorno 3D comparado con un 2D5,6. Por otra parte, ensayos curativos de heridas son difíciles de reproducir y producir resultados cuantitativos7,8,9. El análisis de la zona de exclusión de la célula, que es una modificación 3D de ensayo de las heridas, es un ensayo más fisiológico relevante pero no es adecuada para células bajas en número como células híbridas resultantes de celular fusión eventos10,11 .
El análisis de la cámara de Boyden es un ensayo de 3 dimensiones que provee microambientes pertinentes estudios celulares. Sin embargo, necesita extraerse su microentorno original y ser depositado en la cámara alta del sistema de análisis de Boyden para migrar e invadir hacia abajo hacia el medio que contiene chemoattractant. Este enfoque 3D no es apropiado en el análisis de la capacidad de migración y la invasión de células vulnerables a su microambiente o limitada en número de11,10,12. Un enfoque más reciente para analizar la invasión y migración de la célula es la microfluídica cámara gradiente análisis13. Aunque conveniente y fiable en los estudios de migración y la invasión, este análisis son más costoso y pueden ser técnicamente difícil para un laboratorio típico. Describimos aquí un ensayo de invasión vertical invertido simple que es compatible con muchos tipos de células incluyendo las células sensibles a su microambiente o restringidas en número. Este ensayo fue adaptado del protocolo propuesto por Hooper et al. 14. en este ensayo, las células permanecen en su microentorno original y su migración y la invasión se controla mientras se mueven hacia arriba en el gel de colágeno que contiene un chemoattractant11. Este ensayo es reproducible y ha sido optimizado y validado en la placa de cultivo de 35 mm. Podría adaptarse a las condiciones de ensayo diferentes incluyendo tamaños de célula diferente cultura, diferentes matrices o fuerza de adherencia y diferentes atrayentes. Este análisis podrían servir como una plataforma en vitro para la detección inicial en el proceso de descubrimiento de fármacos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos un ensayo de invasión vertical invertido simple que es conveniente para una variedad de tipos de células incluyendo las células que son raros o dependiente en su microambiente. En este ensayo de invasión 3D, las células permanecen en su microentorno original y están cubiertas por el gel de colágeno que contiene un chemoattractant. Las células entonces migraran e invaden en el colágeno. En este ensayo, las células pueden ser manchadas y fácilmente monitoreadas en el gel. La simplicidad y repr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los institutos nacionales de salud (NIMHD-G12MD007581) a través del RCMI-centro de salud ambiental en la Universidad Estatal de Jackson y el Departamento de defensa, Premio Idea 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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