向上移动: 一个简单而灵活的体外三维入侵检测协议
Summary
该协议描述了一种倒置垂直入侵检测方法, 可用于量化三维环境中细胞的迁移和入侵能力, 同时保持细胞微环境。本试验适用于稀有和/或敏感细胞。
Abstract
尽管已经开发了3D 种入侵检测, 但在不影响其微环境完整性的情况下研究细胞仍然是一个挑战。传统的3D 检测 (如博伊登室) 要求细胞从原始的文化位置迁移到新的环境中。这不仅扰乱了微环境固有的细胞过程, 而且常常导致细胞的丧失。这些问题在处理罕见的细胞, 或对其微环境极其敏感时尤其具有挑战性。在这里, 我们描述了一个3D 入侵检测的发展, 避免了这两个问题。在这个实验中, 细胞被镀在一个小井里, 一个含有趋化因子的 ECM 矩阵被放置在细胞之上。这不需要细胞移位, 并且允许细胞向上侵入母体。在这种检测中, 细胞侵袭以及细胞形态学可以在胶原凝胶内进行评估。利用这一方法, 我们对稀有和敏感细胞的侵袭能力进行了表征;由乳腺癌细胞 MCF7 和间充质/多向干细胞 (MSCs) 融合而成的混合细胞。
Introduction
细胞运动是细胞的正常发育和生理过程。然而, 细胞迁移和侵袭的模式和能力的变化与病理状况有关, 包括炎症性疾病和肿瘤转移1,2,3。转移可以说是癌症中最不了解的方面。对于转移, 癌细胞必须降解额外的细胞基质 (ECM), 侵入局部组织和 intravasate。一旦循环, 癌细胞就会传播到远处的部位, extravasate 并形成次生肿瘤。因此, 细胞降解 ECM、迁移和入侵的能力与它们的转移电位有关。对细胞的迁移和入侵能力进行了分析和量化, 并提出了不同的方法。最常用的方法包括伤口愈合试验、时间推移显微镜和博伊登室化验。创伤愈合试验4和时间失效显微镜是简单和方便的化验, 将初步了解细胞迁移。但是, 这两种检测都是2D 检测, 不反映单元格存在体内的3D 环境。研究表明, 与2D 一个5、6相比, 单元格对3D 环境的响应不同。此外, 伤口愈合化验难以重现, 并产生定量结果7,8,9。细胞排斥区的检测, 这是一个3D 修改的伤口愈合化验, 是一个更生理学相关的化验, 但它不适合的细胞数低, 如混合细胞产生的细胞融合事件10,11.
博伊登室化验是一项3维的化验, 为细胞研究提供相关的微环境。然而, 它要求细胞从原来的微环境中移除, 并存放到博伊登化验系统的上腔中, 以便向含有培养基的趋化因子迁移并向下侵入。此3D 方法不适用于分析易受其微环境影响的细胞的迁移和入侵能力, 并且/或限制在数字10、11、12中。一个新的方法来分析细胞迁移和入侵是微流控梯度室化验13。虽然在迁移和入侵研究中, 这种方法是适当和可靠的, 但这种检测方法更昂贵, 在技术上对一个典型的实验室具有挑战性。这里我们描述了一个简单的倒置垂直入侵检测, 它与许多细胞类型兼容, 包括对其微环境敏感的细胞和/或数量限制。这项化验是根据霍普. et . 提出的协议改编的。14. 在本实验中, 细胞保持在原微环境中, 当它们在含有趋化因子11的胶原凝胶中向上移动时, 它们的迁移和侵入受到监测。本试验重现性好, 在35毫米培养皿中进行了优化和验证。它可以适应不同的检测条件, 包括不同的细胞培养大小, 不同的基质或黏附力, 以及不同的趋化因子。这种检测可以作为一种体外平台, 用于药物发现过程的初步筛选。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们描述了一个简单的倒置垂直入侵检测, 这是方便的各种细胞类型, 包括细胞是罕见的和/或依赖于其微环境。在这3D 入侵检测中, 细胞保持在原微环境中, 并被含有趋化蛋白的胶原凝胶所覆盖。细胞然后迁移和侵入胶原蛋白。在这种化验中, 细胞可以被染色和容易地监测在凝胶内。该方法的简便、重现性使其成为研究3D 系统中癌细胞迁移和侵袭的方便工具。然而, 强烈的趋化因子似乎需要?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院 (NIMHD-G12MD007581) 的支持, 通过 RCMI 环境健康中心在杰克逊州立大学和美国国防部, 想法奖 11-1-0205。
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
