Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio
Summary
Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.
Abstract
Embora a invasão 3D ensaios têm sido desenvolvidos, persiste o desafio de estudar células sem afetar a integridade do seu microambiente. Ensaios de 3D tradicionais tais como a câmara de Boyden exigem que as células são deslocadas do local cultura original e mudou-se para um novo ambiente. Não só faz isso atrapalhar os processos celulares que são intrínsecos para o microambiente, mas muitas vezes resulta em uma perda de células. Estes problemas são especialmente desafiadoras quando se lida com as células que são raros ou extremamente sensível ao seu microambiente. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de invasão 3D que evita as duas preocupações. Neste ensaio, as células são banhadas dentro de um pequeno bem e uma matriz de ECM contendo um quimiotático é colocada no topo das células. Isto requer nenhum deslocamento de célula e permite que as células invadir para cima dentro da matrix. Neste ensaio, invasão da célula, bem como a morfologia da célula pode ser avaliada dentro do gel de colágeno. Usando este teste, podemos caracterizar a capacidade invasiva das células de raras e sensíveis; as células híbridas resultantes da fusão entre células de câncer de mama MCF7 e mesenquimais/multipotentes haste/estroma células (MSCs).
Introduction
Motilidade celular é um processo fisiológico e de desenvolvimento normal das células. No entanto, as mudanças no padrão e a capacidade das células para migrar e invadir estão associadas com condições patológicas, incluindo doenças inflamatórias e câncer metástase1,2,3. Metástase é, sem dúvida, o aspecto mais mal compreendido em câncer. Para metástase, as células cancerosas deve degradar a matriz extracelular (ECM), invadir o tecido local e intravasate. Uma vez em circulação, as células cancerosas vão divulgar o site distante, extravasate e formar tumores secundários. Portanto, a capacidade das células para degradar o ECM, para migrar e invadir está relacionada ao seu potencial metastático. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para analisar e quantificar os recursos de migração e invasão de células. As abordagens mais utilizadas incluem a ferida cura ensaio, microscopia de lapso de tempo e o ensaio de câmara Boyden. A ferida cura ensaio4 e tempo lapso microscopia são ensaios simples e convenientes que dariam preliminar insight sobre migração celular. No entanto, ambos são ensaios 2D que não refletem o ambiente 3D, no qual existem células em vivo. Estudos têm mostrado que as células respondem de forma diferente para um ambiente 3D em comparação com um 2D5,6. Além disso, ensaios de cura ferida são difíceis de reproduzir e produzir resultados quantitativos7,8,9. O ensaio da zona de exclusão de célula, que é uma modificação 3D da ferida do ensaio de cura, é um ensaio mais fisiologicamente relevante, mas não é apropriado para células baixas no número como células híbridas resultantes de célula fusão eventos10,11 .
O ensaio de câmara Boyden é um ensaio 3-dimensional que fornece o microambiente relevantes para estudos celulares. No entanto, requer células para ser removido de seu microambiente original e depositados na câmara superior do sistema de ensaio de Boyden, migrar e invadir para baixo em direção a médio contendo quimiotático. Esta abordagem 3D não é apropriada ao analisar a capacidade de migração e invasão de células vulneráveis ao seu microambiente e/ou limitada em número de11,de10,12. É uma abordagem mais recente para analisar a invasão e a migração celular gradiente câmara microfluidic ensaio13. Embora adequados e fiáveis em estudos de migração e invasão, este ensaio é mais caro e pode ser tecnicamente desafiador para um laboratório típico. Descrevemos aqui um ensaio de invasão vertical invertida simples que é compatível com muitos tipos de células, incluindo células sensíveis ao seu microambiente e/ou limitados em número. Este ensaio foi adaptado a partir do protocolo proposto pela Hooper et al 14. neste ensaio, as células permanecem na sua original microambiente e sua migração e invasão é monitorado como eles se movem para cima no gel de colágeno contendo um quimiotático11. Este ensaio é reprodutível e foi otimizado e validado no prato 35mm cultura. Isso pode ser adaptado às condições de ensaio diferentes incluindo tamanhos de cultura de células diferentes, diferentes matrizes ou força de adesão e diferentes quimioatraentes. Este ensaio poderia servir como uma plataforma em vitro para triagem inicial no processo de descoberta de drogas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um ensaio simples invasão vertical invertida que é conveniente para uma variedade de tipos de células, incluindo células que são raras e/ou dependente seu microambiente. Neste ensaio 3D invasão, as células permanecem em seu microambiente original em são cobertas pelo gel de colágeno contendo um quimiotático. As células então migram e invadem em colágeno. Neste ensaio, as células podem ser manchadas e facilmente monitoradas dentro do gel. A simplicidade e a reprodutibilidade deste teste o t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581), através do RCMI-centro de saúde ambiental da Universidade de estado de Jackson e o departamento E.U. de defesa, prêmio Idea 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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