נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול
Summary
פרוטוקול זה מתאר של assay הפוכה הפלישה אנכי יכול לשמש כדי לכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים בתוך תפאורה תלת מימדי תוך שמירה על microenvironment תא. Assay הזה מתאים תאים נדירים ו/או רגישים.
Abstract
למרות הפלישה 3D מבחני פותחו, האתגר נשאר ללמוד תאים מבלי להשפיע על microenvironment שלהם התקינות. מבחני 3D מסורתיים כגון תא בוידן דורשים כי תאים שנעקרו מהמיקום תרבות המקורי ועבר למעבר לסביבה חדשה. לא רק זה לשבש תהליכים הסלולר הם מהותי microenvironment, אבל לעתים קרובות התוצאה היא איבוד תאים. הבעיות הללו הן מאתגר במיוחד בהתמודדות עם תאים שהם נדירים או רגישים ביותר שלהם microenvironment. כאן, אנו מתארים את התפתחות assay הפלישה תלת-ממד זה מונע שני חששות. זה assay, התאים הם מצופים במרחק קטן. ובכן, מטריקס ECM המכיל chemoattractant מונחת על גבי התאים. זה דורש אין הזחה תא, וזה מאפשר לתאים לפלוש כלפי מעלה לתוך המטריקס. ב הזה assay, הפלישה תא, כמו גם תא מורפולוגיה יכול להידרש בתוך הג’ל קולגן. שימוש assay הזה, נוכל לאפיין את הקיבולת פולשנית של תאים נדיר ורגיש; התאים היברידית הנובע היתוך בין תאים סרטניים בשד MCF7 mesenchymal/multipotent תאי גזע/משתית (MSCs).
Introduction
תא תנועתיות הוא תהליך התפתחותי פיזיולוגי נורמלי של תאים. עם זאת, שינויים התבנית ואת היכולת של תאים נודדים ולאחר לפלוש הקשורים עם מצבים פתולוגיים כולל מחלות דלקתיות, סרטן גרורות1,2,3. גרורות שדפדפן הוא ההיבט ביותר ממעטים להבין סרטן. כדי גרורות, תאים סרטניים חייבים לבזות את המטריצה סלולרית נוספת (ECM), לפלוש את הרקמה המקומית ואת intravasate. פעם אחת בכל מחזור הדם, התאים הסרטניים להפיץ לאתר מרוחק, בורחת ויוצרים גידולים משניים. לכן, היכולת של תאים כדי לבזות את ECM, כדי להעביר, לפלוש קשורה הפוטנציאל גרורתי שלהם. גישות שונות פותחו כדי לנתח ולכמת את יכולות העברת ופלישה של תאים. הגישות הנפוצה ביותר כוללים את הפצע ריפוי assay, מיקרוסקופיה זמן לשגות ואת וזמינותו קאמרית בוידן. הפצע הריפוי assay4 וזמן לשגות מיקרוסקופ הם מבחני פשוט ונוח שיכול לתת תובנה נדידת תאים ראשוניים. עם זאת, שניהם נמצאים מבחני 2D אשר אינן משקפות את סביבת 3D שבו קיימים תאים ויוו. מחקרים הראו כי התאים מגיבים באופן שונה סביבת 3D לעומת5,אחד62D. יתר על כן, מבחני ריפוי הפצע קשים כדי להתרבות, להניב תוצאות כמותיות-7,–8,–9. וזמינותו תא הדרה, המהווה שינוי תלת-ממדית של הפצע ריפוי assay, וזמינותו רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית אבל זה לא מתאים התאים נמוך במספר כגון תאים היברידית הנובע תא פיוז’ן אירועים10,11 .
וזמינותו קאמרית בוידן הוא assay תלת-ממדי המספק microenvironments הרלוונטי ללימודי הסלולר. עם זאת, זה דורש תאים כדי להסיר את microenvironment המקורי שלהם וכדי לאוגרים התא העליון של מערכת assay בוידן נודדים, לפלוש כלפי מטה לכיוון המדיום המכיל chemoattractant. גישה זו 3D אינו מתאים ולנתח את יכולת העברה ופלישה של תאים לפגיע שלהם microenvironment ו/או מוגבל מספר10,11,12. גישת כדי לנתח נדידת תאים ואת הפלישה הוא microfluidic קאמרית הדרגתיות assay13. למרות מתאים ואמין בלימודי הגירה ופלישה, וזמינותו זה יקר יותר, יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית עבור מעבדה טיפוסי. נתאר כאן וזמינותו פשוטה הפלישה אנכי הפוך זה תואם עם סוגי תאים רבים, כולל תאים רגישים microenvironment שלהם ו/או מוגבלים במספר. Assay הזה היה ממאמרו של הפרוטוקול המוצע על ידי הופר. et al. 14. זה assay, התאים נשארים microenvironment המקורי שלהם, ההגירה שלהם ואת הפלישה מנוטר כפי שהם לנוע כלפי מעלה הג’ל קולגן המכיל של chemoattractant11. זה וזמינותו היא לשחזור, אופטימיזציה, מאומת בצלחת תרבות 35 מ מ. זה יכול להיות מותאם תנאים assay שונים לרבות גדלים התרבות תאים שונים, מטריצות שונות או חוזק הדבקה, chemoattractants שונים. Assay הזה יכול לשמש פלטפורמה במבחנה להקרנה הראשוני בתהליך הגילוי סמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים וזמינותו פשוט הפוך הפלישה אנכי אשר נוח עבור מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאים שהם נדירים ו/או תלויים microenvironment שלהם. זה assay הפלישה תלת-ממד, תאים נשארים microenvironment המקורי שלהם, מכוסים על ידי הג’ל קולגן המכיל של chemoattractant. לאחר מכן, התאים נודדים, לפלוש ב הקולגן. זה assay, התאים יכולים להי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIMHD-G12MD007581) דרך RCMI-המרכז לבריאות הסביבה ג’קסון סטייט, ארה ב. משרד הביטחון, בפרס Idea 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
