Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.
Abstract
Obwohl 3D Invasion Assays entwickelt worden sind, bleibt die Herausforderung, um Zellen zu untersuchen, ohne die Integrität ihrer Mikroumgebung. Traditionelle 3D Tests wie der Boyden Kammer erfordern, dass Zellen verdrängt vom ursprünglichen Speicherort, Kultur und zog in eine neue Umgebung. Nicht nur stört dies die zelluläre Prozesse, die untrennbar mit der Mikroumgebung sind, aber es führt oft zu einem Verlust von Zellen. Diese Probleme sind eine besondere Herausforderung im Umgang mit Zellen, die entweder selten oder extrem empfindlich auf ihrer Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines 3D Invasion-Assays, die beide Probleme vermeidet. In diesem Assay Zellen sind in einem kleinen gut beschichtet und eine ECM-Matrix mit einer Lockstoffgradient auf die Zellen gelegt. Dies erfordert keine Verschiebung der Zelle und ermöglicht es die Zellen, nach oben in die Matrix zu erobern. In diesem Test kann innerhalb der Kollagen-Gel Zellinvasion sowie Zellmorphologie beurteilt werden. Mit Hilfe dieser Assay, kennzeichnen wir die invasive Kapazität der seltene und empfindliche Zellen; die Hybridzellen infolge Fusion von Brustkrebs-Zellen MCF7 und mesenchymalen/multipotenten Zellen Stammzellen/Stroma (MSCs).
Introduction
Zelle Motilität ist ein normaler Entwicklungs- und physiologischen Prozess der Zellen. Allerdings sind Änderungen in der Struktur und die Fähigkeit der Zellen zur Migration und Invasion mit pathologischen Zuständen, einschließlich der entzündlichen Erkrankungen und Krebs Metastasen1,2,3verbunden. Metastasierung ist wohl der am wenigsten verstandenen Aspekt in der Krebstherapie. Um zu metastasieren, müssen Krebszellen zersetzen die extra-zellulären Matrix (ECM), erobern die lokalen Gewebe und Intravasate. Einmal im Umlauf werden die Krebszellen in den entfernten Standort verbreiten, Leber und sekundäre Tumore bilden. Daher die Fähigkeit der Zellen, die ECM zu vermindern, zu migrieren und zu erobern bezieht sich auf ihr metastatische Potential. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um zu analysieren und die Migration und Invasion Funktionen von Zellen zu quantifizieren. Die am häufigsten verwendeten Ansätze umfassen die Wundheilung Assay, Time-Lapse-Mikroskopie und Boyden Kammer Assay. Die Wunde heilende Assay4 und Zeit verfallen Mikroskopie sind einfache und bequeme Assays, die ersten Einblick in die Zellwanderung geben würde. Jedoch sind beide 2D Assays, die nicht die 3D-Umgebung widerspiegeln, die wie Zellen in Vivoexistieren. Studien haben gezeigt, dass Zellen in einer 3D Umgebung im Vergleich zu einem 2D eine5,6unterschiedlich reagieren. Darüber hinaus sind heilende Wunde Assays schwer zu reproduzieren und zu quantitativen Ergebnissen7,8,9ergeben. Die Zelle Sperrzone Assay, die eine 3D Modifikation der Wundheilung Assay ist, ist ein mehr physiologisch relevanten Assay aber es ist nicht geeignet für niedrige Zahl wie z. B. Hybridzellen aus Zelle Fusion Veranstaltungen10,11 Zellen .
Boyden Kammer Assay ist ein 3-dimensionales Assay, der zelluläre Studien relevanten Mikroumgebungen vorsieht. Es erfordert jedoch Zellen aus ihrer ursprünglichen Mikroumgebung entfernt werden und in der oberen Kammer des Boyden-Testsystem zu migrieren und dringen nach unten in Richtung der Lockstoffgradient enthaltenden Medium hinterlegt werden. Diese 3D Methode eignet sich nicht bei der Analyse der Migration und Invasion Fähigkeit der Zellen, die anfällig für ihre Mikroumgebung und/oder in begrenzter Anzahl10,11,12. Ein neuer Ansatz zur Zelle Migration und Invasion zu analysieren ist der mikrofluidischen gradient Kammer Assay13. Obwohl geeignet und zuverlässig in der Migration und Invasion Studien, dieser Test ist teurer und für ein typisches Labor technisch schwierig sein könnte. Wir beschreiben hier einen einfache umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der kompatibel mit vielen Zelltypen, einschließlich der Zellen empfindlich auf ihrer Mikroumgebung und/oder beschränkter Zahl ist. Dieser Test wurde von dem Protokoll vorgeschlagen von Hooper Et al. 14. in diesem Test die Zellen bleiben in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung und ihrer Migration und Invasion wird überwacht, da sie nach oben in das Kollagen-Gel mit einem Lockstoffgradient11bewegen. Dieser Assay ist reproduzierbar und optimiert und validiert in der Kulturschale von 35 mm. Es könnte verschiedene Assay-Bedingungen, einschließlich der verschiedenen Zellgrößen Kultur, verschiedenen Matrizen oder Stärke der Adhäsion und verschiedenen Chemoattractants angepasst werden. Dieser Test könnte als in-vitro- Plattform für die erste Sichtung in der Arzneimittelforschung dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache umgekehrte vertikale Invasion-Probe, die eignet sich für eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich der Zellen, die seltene und/oder ihrer Mikroumgebung abhängig sind. In diesem 3D Invasion-Assay Zellen bleiben in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung und fallen unter das Kollagen-Gel mit einem Lockstoffgradient. Die Zellen dann migrieren und dringen in das Kollagen. In diesem Test werden die Zellen gefärbt und leicht in das Gel überwacht. Die Einfachheit und Reproduzierbarkeit des …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) durch das RCMI-Zentrum für Gesundheit und Umwelt an Jackson State University und das US Department of Defense, Idea Award 11-1-0205 unterstützt.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
