Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol
Summary
Dit protocol beschrijft een omgekeerde verticale invasie-bepaling die kan worden gebruikt om het kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen in een driedimensionale omgeving met behoud van de cel-communicatie. Deze test is geschikt voor zeldzame en/of gevoelige cellen.
Abstract
Hoewel 3D invasie testen hebben ontwikkeld, blijft de uitdaging om te bestuderen van cellen zonder de integriteit van hun communicatie. Traditionele 3D testen zoals de kamer van Boyden vereisen dat cellen worden verplaatst van de oorspronkelijke locatie van de cultuur en verplaatst naar een nieuwe omgeving. Niet alleen is dit de cellulaire processen die inherent is aan de communicatie verstoren, maar het leidt vaak tot een verlies van cellen. Deze problemen zijn vooral een uitdaging bij de behandeling van cellen die zeldzaam, of uiterst gevoelig zijn voor hun communicatie zijn. Hier beschrijven we de ontwikkeling van een 3D invasie assay die beide zorgen vermijdt. In deze test, cellen zijn vergulde binnen een klein goed en een ECM-matrix met een chemoattractant bovenop de cellen wordt gelegd. Dit vereist geen verplaatsing van de cel, en laat de cellen binnen te vallen naar boven in de matrix. In deze test, kan cel invasie, alsmede de morfologie van de cel worden beoordeeld binnen de collageen-gel. Met behulp van deze test, karakteriseren wij de invasieve capaciteit van zeldzame en gevoelige cellen; de hybride cellen als gevolg van de fusie tussen borstkankercellen MCF7 en mesenchymale/Multipotente cellen stamcellen/stroma (MSCs).
Introduction
De beweeglijkheid van de cel is een normale ontwikkelings- en fysiologische proces van cellen. Veranderingen in het patroon en het vermogen van de cellen om te migreren en binnenvallen zijn echter geassocieerd met pathologische voorwaarden, met inbegrip van inflammatoire ziekten en kanker uitzaaiingen1,2,3. Metastase is aantoonbaar de meest slecht begrepen aspect van kanker. Om het metastaseren, moet kankercellen degraderen van de extra-cellulaire matrix (ECM), binnenvallen het lokale weefsel- en intravasate. Zodra in omloop, de kankercellen naar de verre site verspreiden zullen, extravasate en secundaire tumoren vormen. Dus de mogelijkheid van cellen te degraderen de ECM, te migreren en te vallen is gerelateerd aan hun gemetastaseerde potentieel. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om te analyseren en te kwantificeren van de mogelijkheden voor migratie en invasie van cellen. De meest gebruikte benaderingen omvatten de wond genezing assay, time-lapse microscopie, en de bepaling van Boyden kamer. De wond genezing assay4 en tijd vervallen microscopie zijn eenvoudige en gemakkelijke testen die zou voorontwerp inzicht geven in cel migratie. Beide zijn echter 2D testen die komen niet overeen met de 3D-omgeving waarin cellen in vivo zijn. Studies hebben aangetoond dat de cellen anders op een 3D-omgeving in vergelijking met een 2D één5,6 reageren. Bovendien zijn wond helende testen moeilijk te reproduceren en te8,9van de7,van de kwantitatieve resultaten opleveren. De cel uitsluiting Zone-bepaling, die een 3D-wijziging van de wond genezing assay is, is een meer fysiologisch relevante test maar het is niet geschikt voor cellen lage aantal zoals hybride cellen ten gevolge van cell fusion evenementen10,11 .
De bepaling van de kamer Boyden is een 3-dimensionale test waarmee de relevante microenvironments voor cellulaire studies. Nochtans, vereist het cellen uit hun oorspronkelijke communicatie moet worden verwijderd en de bovenste kamer van de Boyden assay systeem om te migreren en vallen naar beneden richting het chemoattractant met medium worden gestort. Deze 3D-aanpak is niet geschikt in het analyseren van het migratie en invasie vermogen van cellen kwetsbaar voor hun communicatie en/of beperkt in nummer10,11,12. Een nieuwere benadering cel migratie en invasie te analyseren is de microfluidic kleurovergang kamer assay13. Hoewel geschikte en betrouwbare migratie en invasie studies, deze test is duurder en technisch uitdagend kon worden voor een typische laboratorium. Hier beschrijven we een eenvoudig omgekeerde verticale invasie assay die compatibel is met veel celtypen, met inbegrip van cellen gevoelig voor hun communicatie en/of beperkt in aantal. Deze test werd aangepast van het protocol door Hooper et al. voorgestelde 14. in deze test, de cellen blijven in hun oorspronkelijke communicatie en hun migratie en invasie wordt gecontroleerd als zij zich verplaatsen naar boven in de collageen-gel met een chemoattractant11. Deze test is reproduceerbaar en is geoptimaliseerd en gevalideerd in de schotel 35-mm cultuur. Het kan worden aangepast aan verschillende assay omstandigheden waaronder verschillende cel cultuur maten, verschillende matrices of kracht van hechting, en verschillende chemoattractants. Deze test kan dienen als een in vitro -platform voor eerste screening in de drug discovery-proces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudig omgekeerde verticale invasie assay die handig is voor een aantal celtypes, met inbegrip van cellen die zeldzaam en/of afhankelijk van hun communicatie zijn. In dit 3D invasie assay, cellen blijven in hun oorspronkelijke communicatie en worden gedekt door de collageen-gel met een chemoattractant. De cellen vervolgens migreren en binnen te dringen in het collageen. In deze test, kunnen de cellen worden gekleurd en gemakkelijk gecontroleerd binnen de gel. De eenvoud en de reproduceerbaarhei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) door het RCMI-centrum voor milieu en gezondheid aan Jackson State University en het Amerikaanse ministerie van defensie, idee Award 11-1-0205.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
