上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル
Summary
このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。
Abstract
3 D 浸潤アッセイを開発しているが、その微小環境の整合性に影響を与えずに細胞を研究課題が残っています。ボイデン室必要セルが元の文化場所から避難して、新しい環境に移動するなど、従来の 3次元の試金します。だけでなく、これが、微小環境に固有な細胞プロセスを混乱させる、それは多くの場合細胞の損失の結果します。まれ、かの微小環境に非常に敏感な細胞を扱うとき、これらの問題は特に挑戦的です。ここでは、両方の問題を回避する 3 D 浸潤能の測定法の開発について述べる.この分析では、小規模でも細胞をめっきし、走化性因子を含む ECM 行列をセルの上に置いた。これはセル変位を必要としない、上向きマトリックスへの侵入セルをできます。このアッセイでは、細胞の形態と同様、細胞浸潤は、コラーゲン ・ ゲル内で評価できます。この試金を使用して、我々 は稀で、敏感な細胞の侵襲的な容量を特徴付ける乳癌細胞 MCF7 と間葉系/多能性の融合から生じるハイブリッド細胞幹/間質細胞 (MSCs)。
Introduction
細胞運動は細胞の正常発達的および生理学的プロセスです。ただし、パターンと移行し、侵入する細胞の能力の変化は、炎症性疾患、がん転移1,2,3などの病態に関連付けられます。転移がんで最も悪い理解の側面といえます。転移、がん細胞は細胞外マトリックス (ECM) が低下する、ローカル組織および intravasate に侵入する必要があります。循環では、がん細胞は、遠くのサイトに発信する、extravasate、二次性腫瘍を形成します。したがって、能力 ECM を低下させる細胞の移行して侵入するが、転移能に関連します。異なるアプローチは、分析、細胞の移行と侵略の機能を定量化して開発されています。最もよく使われる方法には、創傷治癒の試金、微速度顕微鏡観察、ボイデン室アッセイが含まれます。創傷治癒の試金4と時間経過顕微鏡検査、細胞遊走に予備的な洞察力を与えるだろう簡単で便利な試金。ただし、細胞が生体内で存在する 3 D 環境を反映して 2 D の試金はどちらも。研究では、細胞が 2 D 15,6と比較して 3 D 環境に異なる反応することを示しています。さらに、創傷治癒の試金は再現し、量的な結果7,8,9をもたらす困難です。創傷治癒のアッセイの 3 D の変更、セルの除外ゾーンの試金はもっと生理学的に関連するアッセイが細胞融合イベント10,11 から生じるハイブリッド細胞など数の少ないセルに適していません.
ボイデン室アッセイは、細胞研究関連微小を提供する 3 次元試金です。ただし、セルの元の微小環境から削除して移行し、走化性因子含む培地に向かって下方に侵入・ ボイデン ・ アッセイ系の上部室に預けられるが必要です。この 3 D のアプローチは細胞の微小環境やで限定数10、11,12に脆弱性の移行および侵略の機能の分析に適していません。細胞の遊走・浸潤を分析する新しいアプローチは、マイクロ流路勾配商工会議所アッセイ13です。適した、移行および侵略の研究の信頼できる、この試金はより高価な典型的な実験室の技術的に困難な場合が。ここで、微小環境に敏感な細胞を含む多くの細胞の種類と互換性があるおよび/または数の制限は、単純な反転垂直浸潤アッセイについて述べる。この試金はフーパーらによって提案されたプロトコルから適応されました。14します。 この分析では、セルのまま彼らの元の環境での移行と侵略が走化性因子の11を含むコラーゲン ・ ゲル内上方に移動ことを監視します。この試金は再現はされて最適化し、35 mm ディッシュで検証します。それは、異なるセル文化のサイズ、異なるマトリックス付着、および異なる塩基の強さなどさまざまな分析条件に適応できます。この試金は、創薬プロセスの初期スクリーニングのための in vitroプラットフォームとして役立つことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、様々 な細胞などの微小環境に依存したり、まれにあるセルに便利です簡単な反転垂直浸潤能の測定法について述べる.この 3 D 浸潤アッセイの細胞は彼らの元の微小環境の維持し、走化性因子を含むコラーゲン ゲルで覆われています。セルは移行し、コラーゲンに侵入します。このアッセイで細胞を染色し、ゲル内で簡単に監視できます。シンプルさとこのアッセイの再現性は、3 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ジャクソン州立大学と米国防、アイデア賞 11-1-0205 部環境衛生 RCMI センターを通じて健康の国民の協会 (NIMHD G12MD007581) によって支えられました。
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
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