Questo protocollo descrive un’analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.
Sebbene siano state sviluppate le analisi 3D invasione, la sfida rimane per studiare le cellule senza intaccare l’integrità del loro microambiente. 3D tradizionali dosaggi come la camera di Boyden richiedono che le cellule vengono spostate dalla posizione originale cultura e spostate in un nuovo ambiente. Non solo fa questo interferire con i processi cellulari che sono intrinsechi al microambiente, ma spesso risulta in una perdita di cellule. Questi problemi sono particolarmente impegnativi, quando si tratta di cellule che sono rari, o estremamente sensibili alla loro microambiente. Qui, descriviamo lo sviluppo di un saggio di invasione 3D che evita entrambi preoccupazioni. In questo saggio, cellule sono placcate bene all’interno di una piccola e una matrice di ECM contenente un chemoattractant è disposto in cima le cellule. Ciò non richiede alcun spostamento di cella e permette alle cellule di invadere verso l’alto nella matrice. In questa analisi, l’invasione delle cellule, come pure la morfologia delle cellule può essere valutata all’interno del gel di collagene. Usando questa analisi, ci caratterizzano la capacità invasiva delle cellule rare e sensibile; le cellule di ibrido risultante dalla fusione tra cellule di cancro al seno MCF7 e mesenchimali/multipotenti staminali/stroma cellule (MSCs).
Motilità cellulare è un processo fisiologico e dello sviluppo normale delle cellule. Tuttavia, i cambiamenti nel modello e la capacità delle cellule di migrare e invadere sono associati con patologie tra cui malattie infiammatorie e cancro metastasi1,2,3. Metastasi è senza dubbio l’aspetto più mal capito nel cancro. Per riprodurrsi per metastasi, le cellule tumorali devono degradare la matrice extracellulare (ECM), invadere il tessuto locale e intravasate. Una volta in circolazione, le cellule tumorali si diffonderanno al sito distante, MPEG e formare tumori secondari. Di conseguenza, la capacità delle cellule di degradare la ECM, migrare e invadere è relativo al loro potenziale metastatico. Diversi approcci sono stati sviluppati per analizzare e quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule. Gli approcci più utilizzati comprendono la cicatrizzazione di dosaggio, time-lapse microscopia e analisi dell’alloggiamento di Boyden. La ferita guarigione dosaggio4 e tempo lapse microscopia sono analisi semplice e conveniente che vi darà luce preliminare nella migrazione cellulare. Tuttavia, entrambi sono le analisi 2D che non riflettono l’ambiente 3D in cui le cellule si trovano in vivo. Gli studi hanno indicato che le cellule rispondono in modo diverso in un ambiente 3D rispetto ad un 2D si5,6. Inoltre, saggi di guarigione della ferita sono difficili da riprodurre e a produrre risultati quantitativi7,8,9. Analisi della zona di esclusione di cella, che è una modifica 3D della ferita guarigione saggio, è un test più fisiologicamente rilevanti, ma non è adatto per le celle in basse in numero, ad esempio cellule ibride derivanti dalla cella fusione eventi10,11 .
L’analisi della camera di Boyden è un dosaggio di 3-dimensionale che fornisce microambienti rilevanti per gli studi cellulari. Tuttavia, esso richiede le cellule per essere rimosso dal loro microambiente originale e ad essere depositati nella camera superiore del sistema di dosaggio Boyden di migrare e invadere verso il basso verso il chemoattractant contenente il mezzo. Questo approccio 3D non è appropriato nell’analizzare la capacità di migrazione e l’invasione delle cellule vulnerabili a loro microambiente e/o limitata nel numero10,11,12. Un approccio più recente per analizzare l’invasione e la migrazione cellulare è la microfluidica gradiente camera dosaggio13. Anche se adatto e affidabile negli studi di migrazione e invasione, questo dosaggio è più costoso e potrebbe essere tecnicamente difficile per un tipico laboratorio. Descriviamo qui un saggio di semplice invasione verticale invertito che è compatibile con molti tipi di cellule tra cui cellule sensibili alla loro microambiente e/o ristretta nel numero. Questo test è stato adattato dal protocollo proposto da Hooper et al. 14. in questa analisi, le cellule rimangono nella loro microambiente originale e loro migrazione e invasione è monitorato mentre si muovono verso l’alto nel gel collagene contenente un chemoattractant11. Questo test è riproducibile ed è stato ottimizzato e convalidato nella piastra di coltura di 35 mm. Esso potrebbe essere adattato a diverse metodiche tra cui formati di cella diversa cultura, diverse matrici o forza di adesione e chemiotattici differenti. Questo test potrebbe fungere da piattaforma in vitro per lo screening iniziale nel processo di scoperta di farmaci.
Qui, descriviamo un’analisi semplice di invasione verticale invertito che è conveniente per una varietà di tipi di cellule, compreso le cellule che sono rare e/o dipendente da loro microambiente. In questa analisi 3D di invasione, le cellule rimangono nel loro microambiente originale e sono coperti dal gel di collagene che contiene un fattore chemiotattico. Le cellule quindi migrano e invadono nel collagene. In questa analisi, le cellule possono essere macchiate e facilmente monitorate all’interno il gel. La semplicit?…
The authors have nothing to disclose.
Quest’opera è stata sostenuta dai National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) attraverso il RCMI-centro per la salute ambientale alla Jackson State University e il dipartimento della difesa, Idea Award 11-1-0205.
MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |