This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NFκB and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.
Ontsteking is een kanker keurmerk dat de incidentie van kanker en de promotiekansen en uiteindelijk progressie ten grondslag ligt aan metastase. Daarom is het toevoegen van een anti-inflammatoir geneesmiddel met standaard kanker regimenten kan de patiënt uitkomst te verbeteren. Een dergelijk geneesmiddel, aspirine (acetylsalicylzuur, ASA) is onderzocht voor chemopreventie en antitumoractiviteit. Naast remming van de cyclooxygenase-2 prostaglandine as hebben ASA anti-kanker activiteiten ook toegeschreven aan kernfactor ĸB (NFĸB) remming. Omdat langdurig ASA gebruik gastro-intestinale toxiciteit kunnen veroorzaken, is een prodrug strategie met succes geïmplementeerd. In deze prodrug ontwerp het carbonzuur van ASA wordt gemaskeerd en aanvullende farmacoforen opgenomen.
Dit protocol wordt beschreven hoe we gesynthetiseerd een aspirine-fumaraat prodrug, GTCpFE en kenmerk remt de NFĸB route in borstkankercellen en verzwakking van de kanker steelachtige juistebanden, een belangrijke NFĸB-afhankelijke fenotype. GTCpFE effectief remt de NFĸB route bij borstkanker cellijnen terwijl ASA mist elke remmende activiteit, wat aangeeft dat het toevoegen van fumaraat aan ASA structuur aanzienlijk bijdraagt aan de activiteit. Daarnaast GTCpFE toont significante anti-kanker stamcellen activiteit door het blokkeren mammosphere vorming en verzachtende de kanker stamcellen geassocieerd CD44 + CD24 – immunofe-. Deze resultaten stellen een haalbare strategie om verbeterde anti-inflammatoire geneesmiddelen voor chemopreventie en kankertherapie ontwikkelen.
Ontsteking is een kenmerk dat meerdere aspecten van tumorigenese, zoals incidentie en promotie en progressie uiteindelijk metastase 1 ten grondslag ligt. In borstkanker wordt dit verder ondersteund door epidemiologische waarnemingen tonen dat regelmatig gebruik van de klassieke niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddel aspirine (acetylsalicylzuur, ASA) is geassocieerd met een verlaging van zowel de incidentie van borstkanker, en het risico van metastase en herhaling 2,3. ASA werkt voornamelijk door remming van cyclooxygenase-2 activiteit, die vaak wordt opgereguleerd in borstkanker 4,5. Echter kan het anti-kanker effect van ASA ook worden gemedieerd door het onderdrukken van afwijkende nucleaire factor KB (NFKB) signalering 6-8. Dit is belangrijk omdat een gedereguleerde NFKB route bevordert tumorcel overleving, proliferatie, migratie, invasie, angiogenese en therapieresistentie 9-11. NFKB activering route is ook kritisch voor montageeen immuunrespons. Daarom is voor anti-kankertherapie wanneer langdurige remming NFKB gewenst is, moet men de schadelijke bijwerkingen met langdurige immunosuppressie overwegen. Daarom kan ASA dienen als een goed uitgangspunt voor therapeutische optimalisatie.
Een beperking voor ASA toepassing bij kankertherapie is de verhoogde dosering noodzakelijk voor cyclooxygenase 2 en NFKB inhibitie, die worden geassocieerd met gastrointestinale giftigheid, zoals zweren en bloedingen 12,13 maag. Het omwisselen ASA in als prodrug kan maagdarmtoxiciteit ASA verminderen. Om verder te verbeteren potentie en / of voeg functionaliteit, aanvullende structurele elementen of bijkomende farmacoforen kunnen ook worden opgenomen in ester prodrug ontwerp opgenomen. Een dergelijk farmacofoor toegevoegd ASA potentie verhogen tegen de NFKB-route fumaraat, welke we eerder hebben aangetoond belangrijk NFKB route remming 14,15 te zijn.
<p class="jove_content"> We gesynthetiseerd een aspirine-fumaraat prodrug 15, GTCpFE, en de hypothese dat dergelijke hybride molecuul veilige maar krachtig tegen de NFKB route zou zijn. Wij testten de anti-NFKB activiteit in borstkankercellen en het vermogen om borstkanker stamcellen (CSCs) 15, die afhankelijk NFKB signalering voor overleving en groei 16-21 blokkeren. We vinden dat de potentie van GTCpFE tegen NFKB route aanzienlijk verbeterd ASA 15. Daarnaast GTCpFE blokken mammosphere vorming en verzwakt het CSC oppervlak marker CD44 + CD24 – immunofenotype, wat aangeeft dat GTCpFE in staat is om uit te roeien CSCs 15. Deze resultaten stellen het aspirine-fumaraat prodrug als een effectieve anti-inflammatoir middel dat ook de borst CSCs kunnen richten. Wat betreft borstkanker behandeling kan GTCpFE mogelijke behandeling agressieve en dodelijke ziekte.In this protocol, we demonstrated the synthesis of an ASA prodrug, GTCpFE, where the fumarate pharmacophore was incorporated to improve the anti-NFĸB activity in breast cancer cells. GTCpFE is an effective NFĸB inhibitor, whereas ASA itself is not, even at much higher concentrations. The fumarate moiety has anti-inflammatory properties as shown by its ability to inhibit NFĸB signaling in a variety of cell lines and tissues14,25-29. The prodrug strategy described herein, is amendable to other mal…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants provided by the National Institutes of Health (NIH), R01 CA200669 to JF and R01 CA121107 to GRJT, and by a postdoctoral fellowship grant from Susan G. Komen for the Cure to IK (PDF12229484).
RPMI 1640 Red Medium | Life Technologies | 11875-093 | Warm up to 37°C before use |
IMEM | Corning | 10-024-CV | Warm up to 37°C before use |
DMEM / F12 Medium | ThermoFisher | 21041-025 | Warm up to 37°C before use |
MEM NEAA 10mM 100X | Life Technologies | 11140 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
L-Glutamine 100X | Life Technologies | 25030-081 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I-1882 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
Trypsin 2.5% 10X | Invitrogen | 15090046 | |
Methyl Cellulose | Sigma | M0262 | |
B27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | |
EGF | Gibco | PHG0311L | |
NFκB-RE Luciferase Construct | Clontech | pGL4.32 | |
Renilla Luciferase Construct | Promega | pGL4.70 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
NanoDrop Spectrophotometer | ThermoFisher | ||
Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
StepOne Real Time PCR System | Thermo Scientific | ||
Eclipse Microscope | Nikon | ||
CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter | ||
QCapture Software | QImaging | ||
Summit Software | Beckman Coulter | ||
GraphPad Software | Prism | ||
TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 28025-013 | |
100 mM dNTP Set | Invitrogen | 10297-018 | |
Random Hexamers | Invitrogen | 48190-011 | |
Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
Costar 96W, ultra low attachment | Corning | 3474 | |
HBSS, 1X | ThermoFisher | 14025134 | |
CD44-APC conjugated antibody | BD Pharmingen | 560990 | Store at 4°C, protect from light |
CD24-PE antibody | BD Pharmingen | 560991 | Store at 4°C, protect from light |
Recombinant Human TNFα | Fisher | 210TA100 | |
CCL2 Primer Forward Sequence | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
CCL2 Primer Reverse Sequence | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
ICAM1 Primer Reverse Sequence | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
ICAM1 Primer Forward Sequence | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
TNF Primer Forward Sequence | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
TNF Primer Reverse Sequence | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
36B4 Primer Forward Sequence | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
36B4 Primer Reverse Sequence | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
4-Hydroxybenzyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 20806-10G | |
O-Acetylsalicyloyl Chloride | Sigma-Aldrich | 165190-5G | |
Phosphorous Pentoxide | Sigma-Aldrich | 79610-100G | |
Ethyl Fumaroyl Chloride | Sigma-Aldrich | 669695-1G | |
Sodium Sulfate | Sigma-Aldrich | 246980-500G | |
4-Dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 714844-100ML | 0.5 M in tetrahydrofuran |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886-100ML | |
Toluene | Sigma-Aldrich | 244511-100ML | |
Ethyl Acetate | Sigma-Aldrich | 270989-100ML | |
Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757-2L | |
400 MHz FT NMR spectrometer | See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details |