Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
Los nematodos con sus pequeños pero complejos sistemas nerviosos han demostrado ser herramientas poderosas para la comprensión de muchos aspectos de la neurobiología incluyendo el comportamiento. Gran parte de esta investigación se ha centrado en el organismo modelo Caenorhabditis elegans en el que una gran cantidad de diferentes comportamientos han sido diseccionados y analizados con éxito. Estos incluyen mecanosensorial 3, 4 quimiotáctica, thermotactic 5,6 y 7 magnetotáctica influir en el apareamiento 8,9, el aprendizaje 10 y comportamientos de alimentación 11. Sin embargo, otras especies de nematodos más alejadas exhiben conductas que no se observan en el rhabditid C. elegans o, alternativamente, muestran niveles adicionales de complejidad, lo que plantea preguntas pertinentes respecto a su evolución y regulación. Un tal ejemplo de esto se puede observar en el nematodo diplogastrid alejadas Pristionchus pacificus, que muestra mucho más compleja de alimentación seráconductas y ritmos que los observados en C. elegans 1. Esto es a pesar de las dos especies comparten las neuronas faríngeas homólogos 12. Coincidiendo con estos comportamientos de alimentación adicionales, P. pacificus también muestra una variedad en la dieta expandido, ya que son depredadores ávidos, capaces de complementar su dieta bacteriana por también se alimentan de las larvas de otros nematodos. Afortunadamente, P. pacificus se ha desarrollado como un modelo para la biología evolutiva comparativo e integrador y por lo tanto muchas herramientas moleculares y genéticos están ahora disponibles. Estos incluyen un genoma secuenciado en su totalidad y anotado 13, las herramientas moleculares y genéticos, incluyendo los transgenes 14 y CRISPR / Cas9 15,16, así como una filogenia detallada y bien anotado 17 con más de 25 especies estrechamente relacionadas, incluyendo su especie hermana recién descubiertos. Además, la ecología de numerosas especies Pristionchus incluyendo P. pacificus es quell definido con muchas especies ahora Habiéndose descrito compartiendo una asociación necromenic con escarabajos, una serie que comparten con frecuencia con otras especies de nematodos 18. P. por lo tanto pacificus proporciona un excelente sistema modelo con el que para diseccionar la evolución de comportamientos novedosos y su importancia ecológica.
Con el fin de analizar los comportamientos de alimentación en especies de nematodos depredadores tales como P. pacificus hemos desarrollado varios ensayos de comportamiento novedosas para facilitar la observación y cuantificación de las acciones depredadoras. Como P. pacificus muestra una estructura de boca dimórfico, que influye fuertemente en el comportamiento depredador, la identificación del morfotipo correcta es esencial 1,2. La estrecha morfo stenostomatous boca contiene un solo diente dorsal roma y no participa en ninguna alimentación de depredadores. Por otra parte, la gran metamorfosis eurystomatous boca incluye una mucho más grande en forma de garra del diente dorsal y una contrapuestadiente sub-ventral, que en conjunto operan de manera eficiente para abrir la cutícula de sus presas. La relación de la eurystomatous depredador a la forma stenostomatous no depredadores varía entre las especies Pristionchus y también dentro de P. pacificus, sin embargo, el porcentaje de la boca eurystomatous morph en el P. pacificus cepa de tipo salvaje (PS312) es por lo general 70 – 90% 2. Además, las relaciones de forma boca pueden fluctuar dependiendo de las diferentes influencias del medio ambiente (ambos conocidos, incluyendo la inanición y algunos pequeños de señalización, así como factores desconocidos molécula), la identificación de este modo correcto y el aislamiento de la forma de la boca eurystomatous depredador es esencial para los ensayos de depredadores exitosos.
Junto a la descripción de la forma de la boca depredador hemos desarrollado un "ensayo de mordida" para la observación directa y la cuantificación de los comportamientos depredadores, incluyendo morder, de matar y alimentándose eventos. Aquí nematodos presa son aislados a través del filtroción de las culturas recién desnutridos y adultos expuestos a depredadores P. pacificus, que se observan en conjunto en un lapso de tiempo corto. Además, también hemos desarrollado un alto rendimiento "ensayo de cadáver" para facilitar la detección rápida de comportamiento depredador través de la observación indirecta de eventos predatorios. Esto se aprovecha de la presencia de cadáveres de larvas como una herramienta para la detección de la depredación. Ambos ensayos proporcionan métodos fáciles y altamente repetible para observar y medir el comportamiento depredador de las especies de nematodos como P. pacificus.
Los nematodos proporcionan un sistema de gran alcance para la comprensión de la neurobiología y comportamiento con C. elegans siendo hasta el momento la principal herramienta. Sin embargo, numerosas especies de nematodos incluyendo P. visualización comportamientos pacificus, que están ausentes o varían en complejidad desde el organismo modelo C. elegans y por lo tanto plantean cuestiones fascinantes sobre la evolución y la regulación de estos comportamientos. Un tal comportamiento adicional se encuentra en muchas otras especies de nematodos incluyendo P. pacificus es la capacidad para complementar su dieta bacteriana mediante la participación de la alimentación de los depredadores 1, 20. Por tanto, hemos desarrollado y descrito un protocolo detallado para la caracterización fácil y rápida de estos comportamientos predatorios no analizadas previamente en los nematodos.
En primer lugar, hemos proporcionado métodos para la detección de variaciones en el aparato de alimentación dentro de la boca de los nematodos. La identificación del tipo correcto boca es un primer s esencialTEP para los ensayos de depredación de éxito como, al menos dentro del género Pristionchus únicos animales eurystomatous son capaces de alimentación de depredadores. Es mejor para identificar boca se transforma con el protocolo "rápida boca fenotipificación" se describe en el protocolo de 1,2 ya que este método es que es mucho menos invasiva y por lo tanto es menos probable que los comportamientos depredadores pueden ser perturbados. Sin embargo, se recomienda para convertirse primero familiarizado con las diferentes estructuras de la boca por la identificación con animales anestesiados en las almohadillas de agar (protocolo 1.1).
Después de la identificación de la metamorfosis boca deseada, hemos descrito dos ensayos para cuantificar la alimentación depredadora. Estos son una, de alto rendimiento "ensayo de cadáver" rápida (protocolo 3) y una más tiempo, pero el análisis del comportamiento en mayor profundidad a través del "ensayo de mordida" (protocolo 2). Ambos de estos protocolos son altamente flexible que permite varias modificaciones con el fin de optimizar los ensayos de función de las experimenrequisitos Tal. Para los ensayos de mordedura utilizando P. depredadores pacificus en C. elegans presa, observaciones de las interacciones de comportamiento depredadores para una ventana de tiempo de 10 min era suficiente para cuantificar una cantidad significativa de picaduras junto con otros eventos de alimentación. Para los ensayos de "cadáver" de nuevo utilizando P. depredadores pacificus en C. elegans presa, 5 depredadores durante 2 horas produjo números cadáver fácilmente cuantificables y coherentes que permitan un rápido análisis de comportamiento. Sin embargo, debe tenerse en cuenta diferentes especies de depredadores movimiento nematodo a diferentes velocidades, comer a diferentes velocidades y generalmente demuestran una gran diversidad de otros comportamientos 1. Además, diferentes especies de presa también se pueden comer a tasas diferentes por razones similares. Por ello se recomienda para optimizar los ensayos basados en las especies de nematodos ensayados tanto como depredadores y presas, y también la existencia de diferencias en las condiciones ambientales. Durante los dos "mordida" y "cuerpose "ensayos es fundamental que tanto la presa y los depredadores son saludables, como estrés o depredadores lesionados no van a matar de manera eficiente. Además, las placas de ensayo frescos son esenciales como placas de mayor edad pueden llegar a ser seca que afecta negativamente a la salud de los nematodos que conduce a errónea ensayos. también se espera que las futuras versiones de estos ensayos depredadores serán capaces de tomar ventaja de los recientes avances en la tecnología con el fin de automatizar gran parte del análisis que se ha logrado para la investigación de muchos de los comportamientos observados en C. elegans 21, 22. en la actualidad problemas es probable que surjan en los nematodos tales como P. pacificus como aparecen mucho más sensible al contacto, por lo que el aislamiento e inmovilización en cámaras de microfluidos probables abrogar la alimentación depredador. la superación de este puede ser un reto, pero facilitaría nematodos individuales a ser examinados en búsqueda sutil depredadora comportamientos.
Por último, también hemos proporcionado métodos FOr examinar el aparato de alimentación de los nematodos en sí facilitar las comparaciones entre los modos de alimentación depredadores y bacterianas mediante la cuantificación de la cinética de los dientes y de bombeo faríngeo usando una cámara de alta velocidad (protocolo 4). La cuantificación de las tasas de bombeo de la faringe en C. elegans se ha utilizado para controlar la alimentación durante muchos años 23, sin embargo, C. elegans carece de cualquier forma de denticle boca y también carece de comportamientos abusivos. A través de la combinación de la cuantificación de la faringe de bombeo con el de la actividad de los dientes, se puede también observar cualquier inervación de los dientes específicos a la depredación. Debido a la ampliación necesaria para observar el movimiento de los dientes de los animales a menudo se mueven fuera del plano focal, por lo que es por lo general sólo es posible observar el diente por ventanas de tiempo cortos. Además, a diferencia de C. elegans, la faringe de P. pacificus no bombea de forma continua, sino que se dedica a los hechizos de bombeo y la alimentación. Por lo tanto, para la exacta pum faríngealas tasas de ping mientras que la alimentación que se determinen, es importante registrar 15 segundos de alimentación continua.
Estos métodos presentados aquí, por lo tanto proporcionan el primer marco para la investigación de comportamientos depredadores en los sistemas de nematodos. Por otra parte, también pueden ser adaptables para su uso en la investigación de otras interacciones dentro del ecosistema nematodo incluyendo la influencia de organismos además ecológicamente relevantes en la depredación incluyendo microorganismos, hongos y ácaros . Por tanto, proporcionan un medio para diseccionar cómo se regulan estos comportamientos predatorios, la forma en que pueden haber evolucionado y también su importancia ecológica.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |