Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
그들의 작지만 복잡한 신경계와 선충 행동을 포함한 신경 생물학의 여러 측면을 이해하기위한 강력한 도구를 입증했다. 이 연구의 대부분은 모델 생물 다른 동작의 재산이 성공적으로 해부하고 분석되고있는 예쁜 꼬마 선충에 초점을 맞추고있다. 이들은 thermotactic 5, 6 및 magnetotactic 7에 영향을 미치는, 8, 9 짝짓기 (10) 학습 및 공급 (11)을 행동 4 화성, 3 mechanosensory을 포함한다. 그러나, 다른 더 멀리 관련 선충 종은 rhabditid C.에서 관찰되지 않는 행동을 표시 엘레 또는 대안은 진화 및 규제에 관한 관련 질문을 제기 복잡성의 추가 레벨을 보여줍니다. 이 중 하나 이러한 경우는 훨씬 더 복잡 공급 될 표시 먼 관련 diplogastrid 선충 Pristionchus pacificus에서 관찰 할 수있다haviors와 C에서 관찰 된 것보다 리듬 두 종 상동 인두 신경 (12)을 공유에도 불구하고 간스 1.입니다. 이러한 추가 공급 행동, P.과 일치 그들은 또한 다른 선충의 유충에 공급하여 세균 식단을 보완 할 수있는 탐욕스러운 육식 동물이다로 pacificus 또한, 확장 된식이 범위를 표시합니다. 다행히도, P. pacificus는 비교 및 통합 진화 생물학의 모델로 개발되었다 때문에 많은 분자 유전 도구를 사용할 수 있습니다. 이들은 완전히 시퀀스 및 주석 게놈 (13), 형질 전환 유전자 14 CRISPR / Cas9 (15, 16)뿐만 아니라 새로 발견 된 자매 종을 포함하여 25 밀접하게 관련 종 상세하고 잘 주석 계통 (17)를 포함하는 분자 유전 학적 도구가 포함되어 있습니다. 또한, 다수의 Pristionchus 종의 생태는 P. 등 pacificus 우리입니다많은 종으로 정의 게요 지금 풍뎅이 딱정벌레와 necromenic 협회, 그들은 자주 다른 선충 종 (18)와 공유 호스트를 공유 설명 된. P. pacificus 따라서 새로운 행동의 진화 및 생태 학적 중요성을 해부하기에 훌륭한 모델 시스템을 제공합니다.
이러한 P. 같은 선충 종의 약탈 먹이 행동을 분석하기 위해 pacificus 우리는 쉽게 관찰과 약탈 행위의 정량화에 대한 몇 가지 새로운 행동 분석을 개발했다. P.로 pacificus 강하게 올바른 morphotype의 식별이 필수적 1, 2 인, 약탈 행동에 영향을 미치는 동종 이형 입 구조를 표시합니다. 좁은 입 stenostomatous 모프는 하나의 무딘 등의 치아를 담고 있으며, 어떤 약탈 공급에 관여하지 않습니다. 또한, 넓은 입 eurystomatous 모프는 훨씬 더 큰 갈고리 모양의 지느러미 치아와 반대 추가를 포함함께 효율적으로 먹이의 표피를 열고 운영 서브 복부 치아. 비 약탈 stenostomatous 형태로 약탈 eurystomatous의 비율은 P. 내에 Pristionchus 종에 따라 다르며 pacificus 그러나 eurystomatous 입의 비율은 P.에 모프 90 % 2 – pacificus 야생형 균주 (PS312)는 일반적으로 70이다. 또한, 입 형태의 비율이 (모두 알려진 기아뿐만 아니라 알 수없는 요인으로 신호 몇 가지 작은 분자 포함) 환경의 영향을 다른 약탈 eurystomatous 입 양식, 따라서 정확한 식별 및 격리에 따라 변동될 수 있습니다 성공적인 약탈 분석을 위해 필수적이다.
약탈 입 양식에 대한 설명과 함께 우리가 직접 관찰하고, 물고 죽이고 이벤트를 먹이 포함 약탈 행위의 정량화를위한 "물린 분석"을 개발했습니다. 여기에 먹이 선충은 필터를 통해 분리된다새로 굶주린 문화의 보내고과 약탈 성인 P.에 노출 짧은 시간 범위 동안 함께 관찰된다 pacificus. 또한, 우리는 육 이벤트 간접적으로 관찰 육 동작의 신속한 선별을 용이하게하기 위해 고 스루풋 "시체 세이"를 개발 하였다. 이 포식을 선별하는 도구로 애벌레 시체의 존재 활용합니다. 두 분석은 관찰 및 P. 같은 선충 종에서 약탈 행위를 측정하기위한 간단하고 매우 반복적 인 방법을 제공 pacificus.
선충은 C.에 신경 생물학 및 행동을 이해하기위한 강력한 시스템을 제공 엘레은 지금까지 기본 도구 인. P.를 포함하지만, 많은 선충 종 결석 또는 모델 생물의 C.에서 복잡 다양 pacificus 표시 행위, 엘레 따라서는 이러한 행동의 진화 및 규제에 관한 흥미로운 질문을 제기. P. 포함하여 많은 다른 선충 종에서 발견 한 같은 추가 행동 pacificus이 약탈 공급 (1), (20)에 결합하여 세균의 식단을 보완 할 수있는 능력이다. 따라서 우리는 개발 및 선충에서 이러한 이전에 unanalyzed 약탈 행위의 쉽고 빠른 특성에 대한 상세한 프로토콜을 설명했다.
첫째, 우리는 선충 구강 내 장치를 공급 변동을 선별하는 방법을 제공하고 있습니다. 정확한 입 타입의 식별은 필수적인 제 s의만 eurystomatous 동물이 육식 공급 할 수있는 최소한 Pristionchus 속에서, 같은 성공적인 포식 분석을 위해 TEP. 그것은 훨씬 덜 침습적 인 입이 방법으로 프로토콜 1.2에 기술 된 "빠른 입 표현형"프로토콜로 변경해 파악하는 것이 가장 좋습니다 따라서는 약탈 행위가 교란 될 수 있다는 가능성이 적습니다. 그러나, 첫 번째 한천 패드에 마취 된 동물 (프로토콜 1.1)을 식별하여 다른 입 구조에 익숙해지는 것이 좋습니다.
원하는 입 모프의 식별에 따라, 우리는 약탈 먹이를 정량화이 분석을 설명했다. 이들은 (프로토콜 2)은 "물린 분석"을 통해하지만 더 깊이있는 행동 분석을 소모 빠른, 높은 처리량 "시체 분석"(프로토콜 3)과 더 많은 시간이다. 이러한 프로토콜 모두 experimen에 따라 분석을 최적화하기 위하여 여러 가지 변형을 허용 매우 유연탈 요구 사항. P.를 사용하여 물린 분석을위한 C.에 pacificus의 포식자 엘레 먹이 10 분의 시간 창에 대한 상호 육 행동 관찰은 다른 공급 이벤트와 함께 물기 상당한 양을 정량화하기에 충분했다. 다시 P.를 이용하여 "시체 분석"에 대한 C.에 pacificus의 포식자 엘레 먹이은 2 시간 5 육식 동물은 빠른 행동 분석을 가능하게 쉽게 정량화하고 일관된 시체 번호를 생산했다. 그러나, 다른 속도로 이동 육 선충의 종을 주목해야한다 다른 속도 먹고 일반적으로 다른 행동 한 큰 다양성을 증명한다. 또한, 다른 먹이 종은 비슷한 이유로 다른 속도로 먹을 수있다. 이는 그러므로 환경 조건에 차이에도 포식자 먹이로 모두 테스트 선충 종에 기초하여 분석을 최적화 할 것을 권장하고있다. 모두 "입"과 "군단 중스트레스 또는 부상 포식자 효율적으로 죽이지 않을 것 같은 먹이와 포식자 모두가 건강한 것이 중요합니다 전자 "분석은. 또한, 신선한 분석 플레이트에 악영향 오류로 이어지는 선충의 건강에 영향을 알아 건조 될 수 있습니다 이전 판과 같은 필수 분석법. 또한 많은 C. 관찰 행동 간스 (21, 22)를 조사하는 완성되었다 이러한 육 분석법 미래 반복이 많은 분석을 자동화 할 수 있도록 기술의 최근 발전을 활용할 수있을 것으로 기대된다. 현재 그들은 약탈 먹이를 폐지 할 가능성이 미세 유체 실에 격리와 고정을 훨씬 더 민감 문의하기 나타나는 문제는 P.의 pacificus와 같은 선충에서 발생할 가능성이 있습니다.이 도전 증명할 수 있지만 개별 선충을 용이하게 할 극복은 미묘한 약탈에 대한 검사한다 행동.
마지막으로, 우리는 또한 FO 방법을 제공 한R 고속 카메라 (4 프로토콜)를 사용하여 치아와 인두 펌핑 동역학을 정량함으로써 육 세균 공급 모드 사이의 비교를 용이하게 선충 공급 장치 자체 검사. C.에서 인두 펌핑 속도의 정량화 엘레은 C. 그러나 여러 해 23 먹이를 모니터링하기 위해 이용되고있다 엘레는 입 작은이 어떤 형태의 부족도 약탈 행동이 부족하다. 치아 활동의 펌핑 인두의 정량을 조합 통해 포식 특정 치아의 모든 신경 분포는 또한 관찰 될 수있다. 때문에 동물은 종종 초점면에서 이동 치아 이동을 관찰하는 데 필요한 배율에 따라서는 짧은 시간 창을위한 치아를 관찰하는 것이에만 가능합니다. 또한, C. 달리 엘레, P.의 인두 pacificus는 지속적으로 오히려 펌프와 공급의 주문에 종사, 펌프하지 않습니다. 따라서, 정확한 인두 PUM에 대한공급하면서 핑 속도는 연속 공급의 15 초를 기록하는 것이 중요하다 결정되어야한다.
여기에 제시된 이러한 방법은 따라서 선충 시스템에서 약탈 행위를 조사하기위한 첫 번째 프레임 워크를 제공한다. 또한, 그들은 또한 미생물, 곰팡이 및 진드기를 포함하여 포식에 추가 생태 학적으로 중요한 생물의 영향을 포함하여 선충 생태계 내의 다른 상호 작용을 조사에 사용하기 위해 적용 할 수있다 . 따라서 그들은 또한 자신의 생태 학적 의미를이 약탈 행위가 규제 그들이 어떻게 진화 수있는 방법과 해부 할 수있는 수단을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |